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01月11日

生物仿制药曲妥珠单抗的快速开发和规模扩大:细胞系和工艺开发案例研究

作者 : admin | 分类 : 生物医学 | 超过 7 人围观 | 已有 0 人发表了看法
原标题:生物仿制药曲妥珠单抗的快速开发和规模扩大:细胞系和工艺开发案例研究

与新药相比,生物仿制药的开发面临着从细胞系到首次临床试验(FIH,first in human (clinical trial))的大量前期工作。生物仿制药开发计划需要迅速进行临床前和1期研究,通常不需要进行2期研究,因为最初的原研药物已经确立了剂量和其他患者治疗概念。3期临床研究通常仅限于较少的患者,这最终缩短了总体时间和研发成本。

关键的挑战仍然是:在深入分析的基础上证明可比性和高度相似性,如欧洲药品管理局(EMA),美国食品药品管理局(FDA)和世界卫生组织(WHO)的许多指导文件所概述的那样。与原研产品相比,早期开发通常需要多次迭代。因此,在寻求合适的临床前和临床生产候选药物时,必须采取综合的方法进行细胞系开发以及早期筛选和工艺开发。在这里,我们提出了一种生物仿制药曲妥珠单抗的研究方法,从细胞系到早期开发,均具有可放大的抗体滴度和与临床相关的产品质量属性。

我们的研究开始于表达所需目标蛋白的高表达中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系的开发。尽管重组技术是表达生物治疗药物的强大的工具,但制造成功取决于稳定的表达高蛋白滴度的细胞系。生物药物开发的关键部分是选择正确的细胞,以达到细胞生产率,细胞系稳定性和最终产品质量的目的。最常见的基因表达系统基于二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase,DHFR)和谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)。

然而,传统上说,鉴定合适的细胞系是一个费时、费力的过程,因为它们的生产率和稳定性可能差异很大。必须筛选数千个单克隆,以找到具有最高产量和最佳产品质量特征的克隆。为了改善细胞系选择并减少研发时间,我们使用了较为先进的方法开发了稳定的细胞系。它是基于控制所有哺乳动物细胞内染色质动态组织的DNA的元素。它们可以释放转基因的基因组环境,这是有效表达基因的前提。已经证明,这种方法可防止转基因沉默,并为转基因的所有拷贝提供高转录率。

随后,我们使用摇瓶进行实验设计(DoE)研究,以确定基本培养基和补料培养基策略,并以2升规模反应器确认结果。我们进一步优化了2升培养工艺,以满足所需的产品滴度和质量。开发了三步下游工艺以生产高单体含量。我们成功地将过程扩展到具有上游和下游操作的工艺规模,并具有可比较的过程和产品属性。此过程的每个步骤都得到详细分析的支持:例如,N-聚糖分析以显示可比性和质量,尺寸排阻色谱(SEC)和毛细管等电聚焦(cIEF)和电荷变化为基础来确认质量。

材料和方法

我们采用了当前符合CGMP的CHO-K1 ATCC衍生宿主细胞系,使其在CD Growth A培养基中生长,该培养基是商业化学定义(CD)培养基。为了在整个过程中保持细胞培养环境不变,我们使用了与基础培养基相同的培养基进行转染、单细胞克隆和生产。我们将编码Hc和Lc以及选择标记的基因整合到目标载体中,以保持最大水平的转录。

图1a是我们用来建立用于本研究的细胞系的开发过程的示意图。DNA通过电穿孔传递,以提高转染效率。我们应用了抗生素选择来创建稳定的细胞库,挑选了约100个克隆进行手动扩增,从96孔板扩展到24孔和6孔板。基于免疫球蛋白G(IgG)滴度,我们将选定的单克隆转移到摇瓶中,然后在14天的分批补料过程中进一步检查了表现最好的单克隆细胞。

生物仿制药曲妥珠单抗的快速开发和规模扩大:细胞系和工艺开发案例研究

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图1a:本文使用的细胞系开发过程,在96孔板中进行单克隆筛选,然后手动扩增至6孔板。

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图1B:96孔板中分离的单克隆分析。

我们无需任何抗生素选择即可完成这些扩展步骤,并仔细鉴定和选择适合我们生产要求属性的单克隆。最后,我们收集并测试了10个合格的克隆细胞身份以及内源性和不定性微生物污染物(细菌、真菌和支原体)。为了在核酸水平(遗传稳定性)分析其表达构建体,我们通过定量聚合酶链反应(qPCR)评估了构建载体。最后,我们选择了一个单克隆用于进一步的工艺开发。

工艺开发和按比例放大基础培养基筛选和补料策略开发:

为了评估一组具有不同进补料选项的市售细胞培养基,我们进行了基础培养基筛选研究。为了评估基础培养基和补料培养基的培养基类型、总补料量、补料持续时间和温度变化,我们以100mL工作体积(WV)进行了14次摇瓶研究。然后我们接种了12个摇瓶,以进一步优化补料策略。

为了监测摇瓶中的细胞生长和活力,我们使用了全自动细胞计数仪。为了监测代谢物,我们使用了多功能细胞培养分析仪。我们在第3天采集滴度样品,然后在第5天每天采集样品,当细胞培养活率达到60%生存力时最终收获烧瓶。

细胞培养工艺开发

为了进一步评估和确认工艺参数,例如温度变化,pH和葡萄糖水平,我们运行了两组四个4L规模的生物反应器,评估了两种不同的温度变化条件(34°C和32°C) 。当葡萄糖降至低于3g/L时,其补料量可达4g/L;使用碳酸氢钠-二氧化碳系统控制pH。系统以固定的空气流速和O 2 (按需)将溶解氧(DO)控制在40%的设定点。我们根据摇瓶研究的结果定义了补料策略、总补料量和补料持续时间。

对于种子培养,我们大约每三天将细胞传代一次。对于接种生物反应器之前的最后一个种子培养传代(n–1),我们在配备了温度控制装置的Wave生物反应器中扩增了细胞。下图2显示了此工艺过程。

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图2:2L和20L研究的细胞培养过程设计。

我们每天对培养物进行取样,以测量细胞密度、生存力和代谢产物水平。第3天后,我们每天取样进行分析(包括滴度和质量属性)。当培养细胞活率达到60%生存力时,收获生物反应器。通过无菌过程,我们收集了细胞培养上清并进行了离心,然后通过0.2µm过滤器过滤上清液。收集滤液并将其保存在–80°C的冰箱中,以进行下游处理。

细胞培养工艺规模放大至中试规模

为了证明可放大性,我们将2L工艺放大至20L。我们使用不锈钢生物反应器进行了20L生物反应器运行。该系统维持2L生物反应器细胞培养物中研究的与规模无关的参数(pH、 pCO 2 、补料策略、温度变化等)。比例相关的参数被适当地缩放。我们将空气流速设计为恒定的每分钟体积(vvm),使用环形喷头转换为每分钟0.15标准升(SLPM)。搅拌速度的提高是基于每单位体积流体的恒定功率(P/V),换算为100 rpm。

下游开发和规模扩大

我们开发并扩大了三步纯化工艺,以满足我们20升规模生物反应器运行的要求。下游过程始于使用深层过滤系统对细胞上清进行澄清,然后在层析系统上进行层析色谱工艺操作。蛋白质A捕获步骤使用蛋白A树脂,使用磷酸盐缓冲液(PBS)平衡,然后上样并用PBS淋洗。用PBS和1M氯化钠进行二次淋洗后,我们用PBS进行了最后的淋洗,然后用pH值为3.4的50mM乙酸钠洗脱蛋白质。

病毒灭活步骤后,将中间样品液调至pH5.0。接下来,在阳离子-洗脱模式下进行阳离子交换(CEX)色谱层析,使用阳离子层析介质,用50mM乙酸钠平衡,然后在pH5.0下进行4CV淋洗。再使用20CV使用75至270mM的氯化钠进行梯度洗脱。然后,精纯为阴离子交换(AEX)层析,以流穿模式使用阴离子树脂,pH值为7.8-8.0,使用3CV洗脱。最后,我们先通过除病毒过滤器处理洗脱液,然后在超滤系统中进行超滤(UF/DF)操作。

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图3:2 L和20L研究的下游工艺设计。

分析开发

表1显示了早期开发过程中的典型分析策略。对于当前的概念验证研究,我们考虑了以下方法的一部分。

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结果

我们从选择的单个克隆中制备了研究细胞库(RCB)。下 图4显示了我们最初的摇瓶培养基筛选结果。这些结果帮助我们确定了具有温度变化(TS)的基础培养基(培养基A)和补液培养基(饲料B),从而在运行过程中就活细胞密度(VCD)和生存力而言提供了最佳培养条件。

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图4:随着温度变化的培养基筛选(左);没有温度偏移的培养基筛选(右)

我们的补料策略优化结果(下图5)表明总补料百分比与效价之间存在非线性关系。较高的总补料百分比似乎有益于提高表达量16–20%。但是,超过这一点,添加补料不会显着增加表达量。根据使用软件进行统计分析,从第3天到第18天的每日补料可获得最佳的效价结果。

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图5:补料时间和频率对抗体滴度的影响。

使用2L生物反应器进行的温度漂移研究表明,在34°C的条件下,培养细胞可达到更高的VCD,但与32°C相比,活力下降的幅度更大且更早。重复两次之间的结果是一致的,尽管一次运行中观察到了增长率的变化(下图6)。根据蛋白质A HPLC表达量测量,TS到32°C的细胞培养性能略高于TS到34°C的细胞培养性能。

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图6:比较温度变化(TS)从37°C至32°C和34°C对活细胞密度、细胞活力和表达滴度的影响。

我们研究了pH死区和葡萄糖控制的综合作用,以建立2L工艺,我们将其标记为“黄金批次”。维持pH值高于6.8会导致更高的细胞生长速率和更高的VCD峰值,但存活率很快会下降到60%或更低。相比之下,保持pH>6.6会导致VCD降低的细胞培养,但生存期延长>60%。为了在确保延长寿命的同时获得更高的细胞密度,我们将pH死区设置为6.8–7.2,并根据TS标准将细胞密度达到1× 106 个细胞/mL。为了最大程度地减少pH控制的碱消耗,我们将TS后的pH死区增加到6.6–7.2。

在相同的pH条件下,控制在较低葡萄糖水平(约1g/L)的培养物的VCDs低于在4g/L处最高的VCDs。因此,我们决定将葡萄糖水平维持在4g/L。

工艺规模扩大结果

如下图7所示,尽管20L表达在约2g/L处趋于平稳,但20L规模的过程的代谢曲线与2L规模的过程相比却具有优势。20L工艺的下降速度较慢,因此滴定度超过2.5g/L。

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图7:细胞培养过程放大;(a)活细胞密度和生存力,(b)表达量,(c)葡萄糖谱,(d)乳酸。

我们假设可能需要增加混合速度(P/V)并缓慢添加补料培养基和葡萄糖,以减少pH值、补料和葡萄糖控制的可变性。为了检验我们的假设,我们尝试了慢速推注补料培养基和葡萄糖添加,并增加了搅拌速度。作为扩大规模确认的一部分,我们同时进行了额外的2L培养,同时增加了搅拌,以适应恒定的P/V和类似的饲料添加方案。

如下图8所示,在所有情况下,峰值细胞密度均高于之前的运行,并且20升运行之一的表达量达到3.35g/L。尽管第二轮20升试验仍在类似的轨道上进行,但由于细胞生存能力下降,我们不得不在这种情况下尽早收获反应。这些试验中的一个关键的显着特征是在后期的培养过程中,受控补料策略对乳酸的显着影响,其中新陈代谢转变为乳酸的消耗。

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图8:细胞培养过程的优化放大;(a)VCD和生存力,(b)滴度,(c)葡萄糖谱,(d)乳酸。

我们使用尺寸排阻高效液相色谱(SEC-HPLC)评估蛋白大小,毛细管等电聚焦(cIEF)评估电荷变量,并使用N-聚糖分析进行糖基化分析,评估产品质量。尽管在三个层析步骤后纯度为99.8%,但在UF/DF步骤结束时,单体和宿主细胞蛋白(HCP)的总纯度为90.05%/0.05ng/mg,总产物收率为77%。

通过SEC-HPLC测定,生物仿制药的纯度与原研药分子相当。其他产品属性(例如cIEF电荷变量配置文件)也具有可比性(下图9)。

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图9:与原研分子相比,通过20L实验通过尺寸排阻高效液相色谱(SEC-HPLC)测量的纯度和通过毛细管等电聚焦(cIEF)测量的电荷变量。

因为我们的单克隆抗体(MAb)分子是生物仿制药,所以根据QbD,其N-聚糖谱是设计空间的重要关键质量属性(CQA)。下图10显示了我们对原研产品(黑色)和20升运行产品中的N-聚糖进行比较的结果。显然,原研药分子中存在的糖型也存在于我们生产的抗体中。该糖基化在多个培养中是可再现的并且一致的。

生物仿制药曲妥珠单抗的快速开发和规模扩大:细胞系和工艺开发案例研究

图10:比较原研产品(黑色)和20L培养(蓝色)的N-聚糖。

两种产品中的相对岩藻糖基化含量也相当(下图11)。这是MAb(例如曲妥珠单抗)的另一个重要CQA,其具有生物活性,因为它与效应细胞上Fcγ受体的结合亲和力以及通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性清除靶细胞。然而,在生物仿制药中似乎存在较少的封端的半乳糖基化糖型,并且G0似乎比原研药中相对丰富。正在进行进一步的迭代开发,以通过使用不同的培养基补充剂来提高可比性和相似性。还需要对原研药分子进行其他表征,以帮助我们了解生物仿制药单克隆抗体的批次间差异。

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图11:来自两个不同的20升生物反应器运行的相对糖型含量;对于原研药和20升生物反应器,无糖基化和岩藻糖基化糖型均具有可比性。

一个成功的平台

我们已经证明了整合的细胞系开发工作以及过程开发和扩大规模是加快生物仿制药抗体早期开发的成功模型。我们的方法并未折衷于科学的基于DoE的科学方法,但是它进行了一系列有针对性的实验研究,以满足产品质量和过程放大的需求。该方法已成功使用生物仿制药曲妥珠单抗作为模型分子进行了证明,并已从2升台式规模扩大到20升中试规模过程,该过程可扩展至更大的GMP操作以用于临床样品生产。

单抗表征常用分析缩写:

CD:圆二色谱

CE:毛细管电泳

CE-SDS:十二烷基硫酸钠毛细管电泳

cIEF:毛细管等电聚焦

DSC:热示差扫描法

ELISA:酶联免疫吸附法

FL-HPLC:高效液相色谱,荧光检测

GC:气相色谱

HPLC:高效液相色谱法

iCE:免疫亲和毛细管电泳

ICP-MS:电感耦合等离子体质谱法

IEX-HPLC:离子交换高效液相色谱法

IgG:免疫球蛋白G

LAL:am变形细胞

LC-MS:液相色谱-质谱

PCR:聚合酶链反应

RP-HPLC:反相高效液相色谱

SDS-PAGE:十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳

SEC-HPLC:体积排阻高效液相色谱法

UV-A280:280 nm吸收紫外光谱

文章来源:

3、Guidelines on Evaluation of Similar Biotherapeutic Products. World Health Organization: Geneva, Switzerland, October 2009; www.who.int/biologicals/publications/trs/areas/biological_therapeutics/BS2110Dft_ guidelines_Final_HK_IK_29July_09.pdf.

4、Zelenetz AD, et al. NCCN Biosimilars White Paper: Regulatory, Scientific, and Patient Safety Perspectives. J. Natl. Compr. Canc. Netw. 9, 2011: S1–S22.

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