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01月09日

优化种子培养策略,更快,更低成本的扩大生物制剂生产 ​

作者 : admin | 分类 : 生物医学 | 超过 9 人围观 | 已有 0 人发表了看法
原标题:优化种子培养策略,更快,更低成本的扩大生物制剂生产 ​

生物制品例如单克隆抗体(MAb)的高成本和全球可及性的限制使生物制药行业的注意力集中在快速、经济地开发此类疗法的策略上。优化工艺是一种有助于缩短生产时间并降低商品成本(CoG)的方法 。如今,上游细胞培养过程中的工艺优化使生物制品的生产比以前更小规模且占地面积更小。在上游细胞培养的种子培养中,正在开发针对生产MAb的中国仓鼠卵巢(CHO)单克隆细胞的优化工艺,支持高细胞密度(HCD)细胞库和生产工艺,以减少工厂规模、资本投资和间接成本,同时提高生产效率。

在传统工艺中,单克隆抗体的制备放大种子比例大约为1:5,初始接种量为0.3×106 细胞/mL,采用五到八个转移步骤的种子放大工艺。标准的种子复苏通常在摇瓶中开始,然后通过摇床扩增(RM),再转入50L生物反应器播种。最后到搅拌罐(STR)生物反应器(200 L和500 L)用于生产培养,可以再扩大到容量为2000L。通过在灌注模式下使用2D RM生物反应器(细胞在整个培养过程中停留在指数生长期),将最后一步的存活细胞密度提高至100×106 个细胞/mL,并使种子比率>1:100 这样可以跳过中间的转移步骤。例如,可以将HCD细胞库直接复苏,然后以更大的体积(0.5–2L,取决于HCD细胞体积)接种到RM生物反应器中,从而绕过摇瓶中的细胞培养扩增以及潜在的错误和污染问题,例如需要手动处理烧瓶。另外,在灌注的种子扩大步骤,细胞可以达到更高的密度,以直接接种中试或生产生物反应器,而无需通过多个中等规模的STR生物反应器进行过程转移。这样既减少了步骤数量,又减少了种子培养天数的总数,从而减少了初始投资和可操作的CoG。但是,并非所有产生MAb的CHO克隆都可以优化培养工艺,因为高细胞密度会损害蛋白质表达水平和遗传稳定性。

我们的目标是探索为可优化型、可扩展的细胞培养种子培养方案,培养在HCD中表达商业性单抗的CHO克隆的可能性。我们调查了一次性RM灌注生物反应器(工作体积为1–25L)是否可以实现至少100× 106 的细胞培养密度,在不同工作体积下的活细胞密度(VCD)。使用各种规模的过程分析技术(PAT)监控HCD参数。当RM生物反应器中的培养物(1L工作体积)达到所需的HCD时,使用培养基体积自动扩大到中试规模的STR一次性生物反应器(200 L),然后以分批 补料模式运行。在运行期间,我们测量细胞密度和生存力以及单克隆抗体的关键质量属性(CQA),然后将这些结果与通过标准种子生产工艺的同一单克隆抗体进行了比较。结果确定了HCD灌注种子培养是否可以接种标准生产的几级生物反应器以减少转移步骤的数量,以及是否有可能使用基于PAT的控制制度来自动接种分阶段的过程以减少接种量。

材料和方法

细胞系:我们选择表达人源单抗的CellcaCHO-DG44细胞系来研究使用HCD灌流培养接种中试规模生物反应器的实用性。选择具有相关培养基和细胞培养参数的细胞系进行验证研究,因为用于生产该单克隆抗体的补料分批工艺已被生产企业很好地表征研究。

生物反应器:之所以选择RM20/50生物反应器来进行种子培养研究是因为它不断更新细胞培养基,从而能够在顶空和培养基之间进行质量转移,从而实现高效,低剪切混合。该系统与一次性用的RM灌注袋(工作体积为1-25L)一起使用,该灌注袋由制药级低密度聚乙烯制成,可在整个RM和STR生物反应器袋中使用,以确保质量稳定。每个袋的底部均具有集成的灌注膜,形成了一个隔室,用于在灌注过程中去除无细胞的培养基,从而将细胞的损失或损坏降至最低。RM灌注生物反应器的尺寸从2L到50L(工作体积1L–25L),使用常见的RM生物反应器设计可简化转移工艺。

具有一次性反应袋的生物反应器(200升)用作中试规模的一次性生物反应器。生物反应器的规模从50L到2000L,并使用与不锈钢生物反应器相同的已确立生物反应器设计原理。所有袋子在刻度尺上具有相似的几何形状,以促进工艺转移和放大。

验证研究

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种子驯化研究为了证明RM灌注生物反应器袋中培养的性能和可扩展性,我们在2L、10L、20L和50L的灌注生物反应器袋中将CHO细胞培养了六天。体积为1L、5L、10L和25L,并使用专有培养基和补料以50 PI(细胞/天)的最小细胞特异性灌注速率(CSPR)进料。将细胞在36.8°C,pH6.95和60%DO下培养(以10°角摇摆速率)。在线PAT传感器,包括生物传感器,用于监视和控制培养液的VCD和细胞活率,并实现自动进料。将2L培养物在灌注条件下再培养两天以确定最大VCD。

试验性生物反应器研究:RM灌注生物反应器的VCD模型是根据生物传感器的信号创建的。使用此模型,可以连续在线测量VCD,当细胞达到100× 106 细胞/mL时,计算出的细胞接种量可产生0.33±0.04× 106 细胞/mL的初始细胞密度,将其从RM灌注生物反应器自动转移到中试规模生物反应器。在灌注生物反应器中培养的细胞(400mL,约100× 106 细胞/mL)用于接种200L一次性生物反应器。使用专有培养基和进料在36.8°C,pH7.1和DO60%下将细胞培养12天。在第4天阶段之后分批添加补料。通过B传感器测量并收集VCD和细胞活力数据。取样无细胞的上清液以进行N-聚糖谱分析,以确定MAb产物的质量和滴度。将结果与标准种子培养工艺的历史数据进行比较,标准种子培养工艺的细胞在标准RM20/50袋中培养(14L,约3× 106 细胞/mL),并用于接种200L一次性生物反应器。

结果和讨论

种子培养性能:结果(下图1)显示,在六天内,RM灌注生物反应器可以生长出>90%的活力和>100× 106 细胞/mL的高细胞密度的CHO细胞培养物。与标准RM生物反应器的接种物相比,VCD的数量增加了33倍。这些灌注生物反应器在8天内用2L袋支持细胞培养到170× 106 个细胞/mL的VCD,并具有>90%的存活率,这表明可以在如此高的细胞密度下满足细胞需氧量。

优化种子培养策略,更快,更低成本的扩大生物制剂生产 ​

图1:在2升至50升工作量的RM灌注生物反应器中培养的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的活力细胞密度(VCD)和活力。

在50L的规模测试下,我们的VCD和活力结果都是一致的。使用灌注生物反应器的HCD培养物的重现性和可扩展性表明,该方法可以产生具有足够高VCD的细胞,以直接种到200L的中试生物反应器,表明了其具有使用合适的HCD培养物(例如使用RM10或20)接种2000升生产生物反应器的潜力。

中试研究:使用自动PAT传感器控制的接种套件,将RM灌注生物反应器专有培养基中的细胞用于200L中试规模生物反应器的接种,目标初始细胞密度为0.33±0.04× 106 个细胞/mL 这导致实际的起始细胞密度为0.37× 106 个细胞/mL,这表明PAT传感器可以实现与手动播种相当的接种精度。总共需要使用0.4L来自优化后种子培养物来接种中试规模的生物反应器,而标准种子培养需要的培养物超过13L。因此,与使用来自标准种子培养工艺的细胞相比,使用HCD细胞将中试规模的生物反应器接种所需的接种量要少30倍以上。

中试规模生物反应器从RM灌注生物反应器和传统的分批补料细胞培养物中接种HCD细胞后的补料分批结果(下图2)显示出在整个过程中可比的生长特性。两者均在7天内达到最大VCD 25× 106 且生存力>90%。MAb滴度也相似,使用标准种子培养工艺达到3.5g/L,而优化种子工艺则达到3.2g/L。这些结果表明,在一次性生物反应器中,与以200L规模运行的标准12天补料分批操作相比,使用HCD细胞播种中试规模的生物反应器对细胞生长,活力或滴度没有不利影响。

优化种子培养策略,更快,更低成本的扩大生物制剂生产 ​

图2:用标准或优化种子培养的细胞接种的200L中试规模分批补料培养中VCD和CHO细胞活力的比较。

产品质量:接种标准和优化种子培养的补料分批培养的MAb产品的CQA(下图3)在G2/G0和G1/G0比率的聚糖谱中显示出相似的趋势,并生成了95%的岩藻糖基化形式。从优化种子培养中试规模的生物反应器中培养的细胞的性能结果表明,使用HCD细胞为中试规模的生物反应器接种不会影响产品质量。这表明该方法对于混合灌注/补料分批工艺放大的有用性。

优化种子培养策略,更快,更低成本的扩大生物制剂生产 ​

图3:在200升中试规模分批补料培养的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中接种标准或优化种子培养的细胞后,MAb关键质量属性(CQA)的比较。

结论

生产率和质量此处进行的验证研究表明,一次性使用的RM灌注生物反应器可实现HCD细胞培养(>100× 106 细胞/mL),在从1L到25L的各个工作规模下,其存活率均>90%。研究还表明,HCD细胞(通过自动过程控制进行接种)和用于接种200L生物反应器的标准补料分批培养细胞可产生可比的细胞生长、活力、效价和MAb CQA。我们的结果表明,使用这种优化的种子培养方法可以在不损害产品质量的情况下提高生产率,并有可能提高生物制剂生产的成本效益。

文章来源:

1、Anderlei T, et al. Facility of the Future. DECHEMA Report 2018; https://dechema.de/dechema_media/Downloads/Positionspapiere/SingleUse_FoF+2018+engl.pdf.

2、BioPhorum Operations Group Report. Biomanufacturing Technology Roadmap 2017: Process Technologies; https://www.biophorum.com/download/process-technologies.

4、Matuszczyk J-C, et al. A Rapid, Low-Risk Approach for Process Transfer of Biologics from Development to Manufacturing Scale. BioProcess Int. 18 (5) (2020): 44–51; https://bioprocessintl.com/sponsored-content/biostat-str-bioreactors-a-rapid-low-risk-approach-process-transfer-of-biologics-from-development-to-manufacturing-scale.

5、Rees-Manley A. Evaluation of a Small-Scale Perfusion Mimic for Intensified Processes. Gen. Eng. News 2019; https://www.genengnews.com/resources/tutorial/evaluation-of-a-small-scale-perfusion-mimic-for-intensified-processes.

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