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01月03日

乙肝病毒core蛋白与宿主RNA结合蛋白SRSF10互作抑制HBV RNA产生

作者 : admin | 分类 : 生物医学 | 超过 11 人围观 | 已有 0 人发表了看法
原标题:乙肝病毒core蛋白与宿主RNA结合蛋白SRSF10互作抑制HBV RNA产生

摘要

Abstract

多项研究提示,HBV核心蛋白(HBc)在感染的肝细胞核内可能具有重要的调控功能。为进一步揭示其具体功能,该研究利用蛋白质组学手段,在HBV感染的HepaRG细胞中对与HBc发生相互作用的宿主因子进行了分析。结果显示,HBc的互作组(interactome)主要由参与mRNA代谢的RNA结合蛋白(RNA-binding proteins, RBPs)组成。其中的SRSF10为一主要通过磷酸化依赖途径调控可变剪切(alternative splicing, AS)、控制应激和DNA损伤应答及病毒复制的RBP。通过包括敲减SRSF10和使用SRSF10磷酸化抑制剂(1C8)的系列研究发现,SRSF10可作为限制性因子调控HBV RNA水平,且其去磷酸化状态可能具有抗病毒功效。令人意外的是,敲减SRSF10和1C8处理均不能改变HBV RNA的剪切形式,而只能负性调节新生成(nascent)HBV RNA水平。综上,本研究提示,HBc在HBV感染的细胞核内可与多种RBP发生相互作用以调节病毒RNA代谢,确认了SRSF10这一新的抗HBV限制因子,这为未来研发新的靶向宿主的抗病毒策略提供了思路。

乙肝病毒core蛋白与宿主RNA结合蛋白SRSF10互作抑制HBV RNA产生

HBV是嗜肝性的具有包膜的DNA病毒。其通过结合钠离子牛磺胆酸共转运蛋白(sodium taurocholate co-transporting polypeptide,NTCP)进入肝细胞内,经过去包膜和脱衣壳过程,以松弛环状DNA(relaxed circular DNA,rcDNA)形式存在的3.2 kb大小的病毒DNA转运至细胞核内,并在宿主细胞核内完成rcDNA转化为共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)的过程。cccDNA以附加体形式存在于细胞核内,并作为病毒基因组,转录形成5种大小的RNA,分别是3.5 kb(pre-core RNA和pgRNA)、2.4 kb、2.1 kb和0.7 kb的RNA,能够编码HBeAg、core蛋白(HBc)、病毒聚合酶(P蛋白)、三种表面蛋白(S-、M-和L-HBsAg)和X蛋白(HBx)。病毒通过pgRNA和P蛋白结合并包裹进HBc构成的衣壳的过程形成新的子代病毒。在衣壳内pgRNA逆转录为rcDNA,之后获得包膜分泌至细胞外,或直接进入到细胞核内补充cccDNA池。越来越多的研究发现,在患者血清和肝组织中还存在多种HBV RNA剪接变异体。这些剪接变异体在病毒复制中不是必需的,但可能在HBV致病机制中发挥作用。

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HBc是构成HBV病毒衣壳的唯一结构分子,由183个氨基酸组成,包括衣壳装配必需的N端结构域(N-terminal domain,NTD,aa 1-140)和非必需的C端结构域(C-terminal domain,CTD,aa 150-183)。CTD中包含控制HBc出入细胞核的基序,并具有DNA/RNA结合和分子伴侣的活性。HBc以同源二聚体形式组装核衣壳,衣壳的装配从低速装配成二聚体的三聚化开始,随后高速装配为正二十面体结构的蛋白衣壳。P-pgRNA复合物的包裹发生在HBc的CTD介导衣壳装配期间,同时也是调控pgRNA逆转录为rcDNA的关键步骤。

许多研究发现HBc除有作为结构分子装配为衣壳的功能外,还具有调控病毒感染建立和维持的活性。首先,HBc能够在病毒感染的建立时和补充cccDNA池时进入细胞核,以二聚体或寡聚体、甚至以衣壳样结构形式存在于细胞核内;其次,早期研究中研究者观察到HBc能够结合cccDNA,进而调控核小体定位。HBc与cccDNA的关联在体内外研究中得到进一步证实,并与活跃的转录状态相关;最后,HBc被发现可与多种细胞内基因的启动子区结合。综上所述,已有研究结果强烈提示,HBV病毒生命周期中,HBc在细胞核内的作用仍有待进一步研究。

为此,作者对HBc在人肝细胞细胞核中的相互作用蛋白进行了蛋白质组学分析。结果表明HBc主要和与多种转录后过程相关的RNA结合蛋白(RNA-binding protein,RBP)网络发生相互作用。作者发现这些RBP中的 SRSF10具有抑制HBV RNA合成和累积的作用,为研发新的抗病毒药物提供了新的角度。

01

分化肝细胞的细胞核中HBc相互作用因子主要是宿主RNA结合蛋白

乙肝病毒core蛋白与宿主RNA结合蛋白SRSF10互作抑制HBV RNA产生

图1. dHepaRG细胞核中HBc相互作用蛋白鉴定

HBc相互作用因子的基因注释分析(gene ontology,GO)显示,在核酸酶处理或不处理条件下与HBc显著相关的因子中,约有50%是核酸结合蛋白,属于RBP家族。在核酸酶存在的情况下,鉴定出的丰度最高的蛋白质种类(Q-value : 1.8 x10-29)与RNA转录后过程,特别是剪接相关的因子相关(图2A)。第二大相关类别(Q-value : 4.4x10-14)与核糖体蛋白相关。有核酸酶和没有核酸酶条件下所获得的相互作用分子的相似性表明,这些相互作用大部分发生在没有核酸介导的情况下,或它们形成了致密复合物,使得其中DNA/RNA受到保护免于核酸酶的消化。

由于GO分析得到的主要蛋白类别与剪接过程中涉及的RBP相对应,接下来作者重点研究了与该功能相对应的蛋白,以及有无核酸酶条件下均鉴定出的蛋白(即图1D中用粗体标出的11种蛋白)。11个RBPs的相互作用组学显示,它们之间具有高度的相互联系,并且在HBc共纯化的因子中也发现了它们的几个一级相互作用蛋白(图2B)。

乙肝病毒core蛋白与宿主RNA结合蛋白SRSF10互作抑制HBV RNA产生

图2. 核内HBc相互作用组学分析

对这些RBP的相对丰度分析表明,在HBc复合物中,SRSF10是丰度最高的RBP,其次是RBMX、SRSF1、SRSF5和TRA2B(图3A)。Western blot分析证实了ST-HBc纯化复合物中存在SRSF10、RBMX、DDX17、SRSF2和TRA2B,以及另外两个非RBP因子PARP1和DNAJB2(图3B和3C)。相比之下,Western blot无法证实SRSF1的存在(图3B)。检测不到的原因目前尚不清楚,但可能是由于使用的抗体灵敏度较差。

乙肝病毒core蛋白与宿主RNA结合蛋白SRSF10互作抑制HBV RNA产生

图3. HBc核内相互作用蛋白的验证

02

HBc与多个SRSF10异构体相互作用

这些结果表明,在HBV感染的PHH中HBc和SRSF10和其它先前鉴定的SR蛋白之间存在相互作用。这也表明,HBc可能与不同的SRSF10亚型相关联,进一步表明这种相互作用对病毒生命周期的潜在重要性。

03

SRSF10调节HBV RNA水平

接下来作者研究了SRSF10敲减(knock-down,KD)对HBV感染的影响。在该研究中,用于KD SRSF10的siRNAs分别定位于RRM和RS1编码序列,因此可针对所有共享这些区域的SRSF10亚型,包括那些在Western blot中观察不到的亚型。在PHH中确认siRNA敲减SRSF10不影响NTCP水平,表明HBV的内化不受影响(图4A-4C)后,作者发现SRSF10的敲减显著增加了总HBV RNA和pgRNA的积累,但未影响cccDNA水平(图4D)。在dHepaRG细胞中也观察到类似的结果,但在该细胞模型中,cccDNA水平出现了适度但显著的升高。Northern blot也证实了SRSF10 KD对HBV RNA的影响,证实了三个可观察的HBV RNA分子的增加。与之形成鲜明对比的是,RBMX的KD对HBV复制的影响相反,所有病毒指标水平降低,包括cccDNA(图4E和4F,S3图)。这些结果表明,与HBc相关的RBP在HBV的生命周期中发挥着独特的作用。为确定SRSF10 KD是否对已经建立的HBV感染有类似的作用,作者也进行了感染7天后转染siRNA的KD实验,此时病毒复制已达到平稳状态。在dHepaRG细胞中,可以观察到SRSF10 KD后HBV RNA的增加。与在感染前转染siRNA的细胞中观察到的一致,感染后SRSF10 KD也增加了cccDNA水平,这表明在该细胞系中,SRSF10除了对HBV RNA的影响外,还可能调节cccDNA的循环和/或稳定性。

乙肝病毒core蛋白与宿主RNA结合蛋白SRSF10互作抑制HBV RNA产生

图4. SRSF10或RBMX KD对PHH细胞中HBV复制的影响

最后,为研究SRSF10对HBV RNA的影响是否依赖于HBc,作者使用AAV载体将wt或突变不能产生HBc的HBV基因组导入肝细胞,并比较在没有SRSF10的情况下它们的复制水平(S6A图)。作者使用了两种突变AAV-HBV类型:ATG的点突变(AAVHBVnoHBc),和缺失HBc ATG和P蛋白ORF的起始之间的406个碱基的突变体(AAVHBVΔHBc)。用这三种载体转染dHepaRG细胞可建立HBV感染。通过量化HBV RNA和分泌抗原检测(S6B-S6D图),结果表明AAVHBVnoHBc突变体能够建立HBV感染,AAVHBVΔHBc细胞使用HBsAg检测。SRSF10的KD增加了AAVHBVwt转染细胞的所有病毒指标的水平。值得关注的是,在没有HBc的情况下,SRSF10 KD后检测到的HBV RNA和分泌抗原的增加明显减少,这表明SRSF10的抗病毒作用可能部分依赖于HBc。

综上所述,这些结果表明SRSF10作为一个抑制性因子调节HBV RNA水平。

04

SRSF10磷酸化的小分子抑制剂能够抑制HBV复制和抗原分泌

既往研究表明,SRSF10的活性受到磷酸化的严格控制,磷酸化能够调节其与其它RBP的相互作用和剪接活性。SRSF10的去磷酸化发生在热休克、DNA损伤或有丝分裂期间。近期的研究发现,化合物1C8(图5)能够抑制SRSF10的磷酸化,特别是在serine133,未发现对任何其它SR蛋白有影响。有研究证实,1C8能够抑制HIV-1的复制,机制可能是影响HIV-1转录和拼接进而导致复制所需病毒蛋白水平异常。

乙肝病毒core蛋白与宿主RNA结合蛋白SRSF10互作抑制HBV RNA产生

图5. 1C8对已建立的HBV感染的影响

通过双向凝胶电泳,作者证实1C8可以诱导分化的人肝细胞SRSF10去磷酸化。为了探究1C8对HBV复制的影响,作者首先评估了其在HBV感染的dHepaRG细胞上的作用(图5B)。在这种情况下,使用1C8处理导致病毒RNA和分泌病毒蛋白的减少(图5C)。值得注意的是,这种表型不同于其他抗病毒化合物。这一效应在HBV感染PHH细胞中较弱但仍然存在(图5D)。dHepaRG的剂量依赖分析显示,在不产生细胞毒性的条件下,对HBV RNA /分泌DNA和HBsAg/ HBeAg的半数有效浓度(EC50)分别约10μM和5μM。在随后的分析中,作者试图确定1C8是否在其它HBV基因型上与作者之前所有实验中使用的D型具有同样的活性。在dHepaRG细胞中,作者发现1C8可以抑制C基因型HBV的复制,病毒RNA和所有分泌蛋白显著减少(S9A图)。对其他5个HBV基因型的初步分析也显示,1C8可以显著降低HBsAg和HBeAg的分泌,特别是对基因型G和H,提示其作用可能是泛基因型的。

这些结果表明,1C8可以通过降低HBV RNA水平抑制HBV复制。1C8对HBV RNA的抑制作用与SRSF10 KD后观察到的相反,表明去磷酸化的SRSF10发挥抗病毒活性,在KD实验中,siRNA转染导致去磷酸化的SRSF10的也减少而导致相反的现象。

05

1C8抗病毒作用部分依赖于SRSF10, SRSF10促进HBV RNA的水平减少而不是RNA的剪接

为了验证1C8对HBV RNA积累的影响是否与SRSF10有关,作者结合SRSF10 KD和1C8处理进行了实验(图6A)。根据提出的模型,1C8对病毒RNA产生的抑制作用在耗竭SRSF10后消失。正如之前观察到的,1C8或siSRSF10单独治疗,对HBV RNA水平产生相反的影响。值得注意的是,在接受两种处理的细胞中,敲减SRSF10可以部分地挽救1C8的抑制作用,使其达到与在对照组细胞中观察到的水平相近,但未达到在siSRSF10转染细胞中检测到的水平(图6B和6C)。该结果表明1C8的抗病毒作用依赖于SRSF10。在用1C8处理并敲减SRSF10的细胞中,不能完整的恢复,可以解释为低水平的去磷酸化SRSF10的持续存在。另一种可能是,1C8还靶向其他参与抗病毒作用的细胞和/或病毒因子。

在病毒复制中发挥作用的HBV RNA均是未剪接的。然而,在研究中,已经有多种剪接的HBV mRNA被检测到,这表明,如果存在一种主动的脱离剪接的机制,那么在慢性感染中,这种机制一定是某个阶段局部的和/或无效的。在众多的HBV剪接RNA中,有两种主要的剪接形式能够产生新的病毒蛋白,其中一些可能参与病毒发病机制,目前研究中也发现了含有较短病毒基因组的病毒颗粒。在作者之前的分析中,用于定量检测HBV RNA(总RNA和pgRNA)的引物定位于HBV基因组的无剪接区域。因此,在SRSF10 KD或1C8治疗后观察到的HBV RNA水平变化可能是由于某种剪接变异导致的。为了探索这种可能性,从转染的肝细胞中提取的RNA使用RT-qPCR分析,使用的引物能够特异性地检测每个剪接和未剪接的RNA。出人意料的是,SRSF10敲减细胞中所有HBV RNA变异体的广泛增加,特别是在PHH中。同样,在感染后用1C8处理HBV感染的dHepaRG细胞,无论是剪接的还是未剪接的病毒RNA均显著减少。这些结果表明,SRSF10 KD或1C8各自的促进或抗病毒作用与剪接或未剪接HBV RNA水平的变化无关。这两种治疗方法都可能对HBV RNA的合成和/或稳定性起作用。为验证这一猜想,作者在SRSF10 KD或1C8处理后对总RNA和新生HBV RNA进行量化。通过在收样前2小时内用乙基尿苷(ethynyl uridine,EU)标记新转录的RNA,对新生HBV RNA进行定量检测(图7A和7B)。正如预期,在HBV感染前敲减SRSF10中, dHepaRG细胞中的总HBV RNA增加。相比之下,在转染了siSRSF10的细胞中,新转录的HBV RNA增加了,其水平与观察到的总RNA水平相似(图7C)。对1C8处理的细胞进行同样的分析表明,该化合物同样降低了总HBV RNA和新生HBV RNA(图7D)。综上所述,这些分析结果表明SRSF10和1C8并没有改变HBV RNA的剪接水平,而是通过改变转录和/或新生病毒RNA的稳定性来发挥作用。

乙肝病毒core蛋白与宿主RNA结合蛋白SRSF10互作抑制HBV RNA产生

图6. SRSF10 KD和1C8联合处理对HBV感染的dHepaRG细胞的影响

乙肝病毒core蛋白与宿主RNA结合蛋白SRSF10互作抑制HBV RNA产生

图7. SRSF10 KD和1C8治疗后的新生HBV RNA

讨论

Discussion

本研究分析发现,HBc在细胞核内可与多种RBP发生相互作用,这些RBP分别参与了mRNA代谢的全阶段。在HBV感染的人肝嵌合小鼠的肝细胞中,同样能够发现部分上述蛋白与HBc的相互作用,验证了细胞实验的发现。体内体外实验均揭示这些RBP在HBV复制过程中起到了相应作用,未来可进行更多相关实验进一步验证。

本研究发现HBc可与细胞的多种RBP互作,提示这一相互作用可能通过各种蛋白高度互联的作用网络,从转录和转录后的多个步骤参与HBV RNA的代谢过程。HBc具有与RBP相似的特征,其同样具有一个由7个丝氨酸残基分隔的长段富精氨酸区域(arginine/serine-rich domain, RS domain)组成的带正电的羧基末端(CTD)。当在细菌中表达HBc时,这一特殊CTD表现出较强的RNA结合能力。值得注意的是,一些研究发现HBc同样具有结合DNA的能力,并可与cccDNA发生作用。目前尚未有研究证明HBc能与HBV感染的肝细胞核中的病毒和/或细胞RNA结合,但与一些RBP相同,HBc可能具有与DNA和RNA结合的能力。基于pgRNA组装的实验结果证明,这种结合活性可能由其CTD的磷酸化调节。另一种可能是,HBc与cccDNA和/或RNA的联系,可能间接地通过RNA分子和/或其与细胞RBP的相互作用调控。

在这些与HBc相互作用的RBP中,本研究主要集中研究了在HBc复合体中含量最高的SRSF10。既往研究发现,SRSF10是SR蛋白家族成员,是可变剪切的调控因子,在热休克处理下可发生去磷酸化,可抑制剪切作用。SRSF10去磷酸化水平改变还可控制自身与多种RBP的互作,特别是TRA2A,TRA2B,hnRNPK、F和H。重要的是,SRSF10可影响细胞内多种转录本的可变剪切,这些转录本参与了应激应答、DNA损伤应答、自噬和癌症发生等多种细胞生命活动。在应激反应过程,SRSF10能出现在旁斑(paraspeckle),核应激小体和胞浆应激颗粒中。SRSF10也参与病毒RNA的调控,特别是HIV-1。

研究者在分化后的肝细胞中敲减SRSF10的结果分析发现,耗竭SRSF10可引起病毒RNA、蛋白和分泌的DNA水平的增加,该结果可在人原代肝细胞和dHepaRG细胞中有效重复。这些结果提示,SRSF10可以抑制病毒RNA的产生。虽然本研究发现SRSF10可与HBc互作,但这种互作在调控总体病毒RNA数量中的作用尚不明确。未来的研究应解析HBc在核内病毒RNA的发生过程中起到的作用,以及HBc如何抵抗SRSF10的抑制作用。通过使用SRSF10的磷酸化抑制剂1C8处理HBV感染的dHepaRG细胞和人原代肝细胞,可发现病毒RNA水平显著降低从而抑制了HBV复制,这一结果进一步提示了SRSF10在HBV生命周期中的重要作用。以上实验均提示,去磷酸化形式的SRSF10抑制了HBV复制。HBc的CTD丝氨酸残基的磷酸化是核衣壳在胞浆中形成过程中非常重要的一步,其主要调控了pgRNA组装和逆转录过程。进一步研究如果能鉴定1C8抑制的激酶种类,将对解析其作用模式和对未来研发新型高效的抗乙肝药物具有重要帮助。

最后,本研究发现,与在其他病毒中的研究一致,SRSF10或1C8均不改变HBV RNA的剪切。数据提示SRSF10和1C8是通过作用于新生成HBV RNA而影响HBV复制的。SR蛋白在剪切过程中具有多种作用,除一些比较经典的作用外, SR蛋白可在细胞内病毒RNA代谢的转录、稳定性和出核过程中发挥作用。除pre-mRNA剪切外,一些SR蛋白已被发现可直接或间接的影响RNA聚合酶Ⅱ的CTD磷酸化及刺激转录延伸。未来可进一步研究在1C8处理下,HBc/SRSF10 cccDNA/RNA结合过程中的表观遗传学改变,将有助于了解背后的潜在机制。

综上,该研究揭示了细胞核内HBc可与细胞内RBP结合,同时发现SRSF10是HBV RNA生成过程中的限制因子。因此,未来可进一步评估基于SRSF10的靶向宿主的抗病毒化合物,以期改进现有的抗HBV治疗方案。

文献来源

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