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11月20日

用于靶向调节单抗半乳糖基化和岩藻糖基化的培养基补充剂

作者 : admin | 分类 : 生物医学 | 超过 5 人围观 | 已有 0 人发表了看法
原标题:用于靶向调节单抗半乳糖基化和岩藻糖基化的培养基补充剂

摘要:单克隆抗体是至关重要的生物制剂,是治疗癌症,类风湿性关节炎和其他慢性疾病的最大分子。 抗体糖基化是一个重要的质量属性,对患者安全和生理疗效有影响,在生产过程中可以通过培养基配方和工艺条件等因素进行修改。通过实验设计,我们验证了 2-F-过乙酰基岩藻糖(2FP),尿苷和半乳糖对CHO细胞的生长和代谢,IgG1效价和关键糖基化相关蛋白的基因表达的影响,并记录了在批培养的第4天到第7天中糖型分布如何变化。我们观察到补充剂添加后的主要糖基化变化,其中2FP的添加使抗体岩藻糖基化最多降低48%,半乳糖的添加使半乳糖基化最多增加21%,尿苷的添加分别降低岩藻糖基化6%和增加半乳糖基化2%。半乳糖和2FP对糖基化有重大影响,但均未显着影响细胞培养物的生长,代谢或效价。而尿苷将峰值细胞密度提高了23%,但滴度却降低了约30%。补充剂添加后在培养的第4天引起基因表达发生显着变化,其中添加2FP显着降低岩藻糖基转移酶8和核苷酸糖转运蛋白基因表达(约2倍),尿苷添加显着提高UDP‐GlcNAcTSLC35A3)和B4GALT1–6的表达(1.5–3倍)。 这些基因表达结果与糖基化、代谢和生长结果一起提高了我们对培养基补充剂影响的细胞机制的理解,并提出了在抗体生产过程中修改抗体糖基化的方法。

背景介绍

单克隆抗体(mAbs )在治疗多种疾病方面非常有效,已成为生物治疗行业发展的推动力(1 )。美国食品药品监督管理局(FDA )批准了86 种以上的mAb mAb 衍生物,目前在临床试验中还有约90 多种(2 )。例如,在2019 年,在FDA 批准的20 种生物制剂中,有9 种是抗体,抗体片段或抗体偶联物(3 )。在商业上,单克隆抗体市场在2017 年超过980 亿美元,预计到2024 年将进一步扩展至1280 亿美元(2,3 )。将生物制剂推向市场的平均成本约为13 17 亿美元(4 ); 因此,通过改进细胞系工程、工艺设计和质量控制来简化新商业产品的开发,可以降低这些开发成本,并提高整体的可及性。单克隆抗体通常由悬浮适应的中国仓鼠卵巢(CHO)或鼠骨髓瘤细胞通过补料分批的方式生产,产生的单克隆抗体滴度通常在3 - 8 g/L之间(5)。产品放行的关键产品质量规范包括蛋白质糖基化、电荷变异和其他蛋白质修饰(5)

免疫球蛋白G1 IgG1 )同种型中的所有mAb 在其蛋白质结构中均具有保守区,并且在Fc CH2 域内的Asn297 残基处被N- 糖基化(6 )。N- 糖基化是一种异源性且非模板化的翻译后修饰,其始于分泌途径第一部分内质网Asn297 残基处寡糖的添加和初始重塑(7 )。进一步的反应发生在第二个反应室- 高尔基体中- 对初始寡糖的酶促修饰形成两个N- 乙酰氨基葡萄糖糖和双天线三甘露糖核心的基本结构(7 )。当抗体在分泌前穿过高尔基体时,三甘露糖核心的每个触角可能会进一步被其他N- 乙酰氨基葡萄糖,半乳糖和唾液酸残基修饰(7 )。尽管其他蛋白质的糖基化模式可能更加多样化,但由于Fc 区和糖基转移酶之间的空间相互作用,mAb 的结构多样性有限(6 )。不同的末端糖会影响抗体的稳定性,血清半衰期和治疗功能,核心N- 乙酰氨基葡萄糖残基的岩藻糖基化可显着影响抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(6 8 )。确实,减少的岩藻糖基化可以使ADCC 增加100 倍,而末端半乳糖基化增加可以增加依赖补体的细胞毒性(6 8 )。最终分泌的抗体库因特定糖型的丰度而异,某些聚糖端基比其他糖基更普遍。

生长条件,产生mAb CHO 系之间的差异以及培养基的配方都会影响治疗性抗体的最终糖型谱。温度,pH pCO 2 等培养条件的变化可通过改变细胞代谢中的酶水平和糖基转移酶活性来影响细胞生长速率和糖型(9; 10; 11 )。在产生mAb CHO 细胞系中,糖型变化可能是由细胞分裂过程中自然发生的遗传和表型变化引起的(这种现象称为基因组漂移)。确实,通过稳定产生mAb 的细胞系和使用药物筛选获得高生产率的克隆在生产过程中糖型差异更大(12 )。CHO 细胞通常在化学成分明确的培养基中生长,这些培养基通常缺乏血清,染料或动物来源的成分。由于成本和专利保护的原因,拥有内部和外包介质配方的生物制药公司通常不会公开其商业介质产品的最终配方。但是,已经确定了某些补充剂会影响培养生长速率、单抗滴度和最终产品质量,这些补充剂可以在不同配方的培养基中成功地控制所需的特性(13 14 )。例如,已显示2-F- 过乙酰基岩藻糖(2FP )的补充可通过抑制岩藻糖基转移酶8 FUT8 )使mAb 中的岩藻糖基化降低多达75 %(15; 16 );半乳糖的添加提高了抗体的整体半乳糖基化(17 );尿苷(低于10 mM 浓度)的存在提高了滴度,整体活细胞密度和半乳糖基化(15; 18,19 )。在先前的报道中已经讨论了使用设计有这些补充剂和其他小分子的实验策略来探索对细胞生长和糖型的影响(15; 18 )。事实上,尿苷(1-24 mM) 和半乳糖(5-120 mM) 的组合已被证明可诱导抗体半乳糖化的浓度依赖性变化(15 19 )。然而,这些先前研究的重点通常只涉及操纵mAb 的半乳糖基化,只有少数报道采用添加策略来控制抗体岩藻糖基化(15; 20 )。此外,这些研究没有研究补充剂对细胞生理的影响,进一步将其与生物过程输出联系起来。一些研究确实验证了补充剂对批培养和补料分批培养工艺中糖型的生理影响(21;17; 22 ),但是,为了充分了解培养基补充对生物过程结果的影响,还需要进行其他全面调查。如我们在本研究中所描述的,从过程水平到分子水平对产生单克隆抗体的CHO 细胞培养物进行表征,为小分子补充及如何改变细胞生长和行为、抗体产量和抗体糖型分布提供了机理上的见解。从这些生物过程中推断出的代谢信息和机制,而不仅仅是工艺性能和产品特性,应该为提高成本和时间效率的细胞系选择、工艺开发和培养基配方提供额外的选择。

展开全文

在这项研究中,我们用2FP ,半乳糖和尿苷添加到产生mAb CHO 细胞的批培养过程中,测试每种补充剂对细胞生长,生产力和基因表达的影响。具体来说,我们采用实验设计方法,采用统计学设计的补充策略,使用2FP ,尿苷和半乳糖对mAb 的岩藻糖基化和半乳糖基化进行靶向操纵,并且研究了在7 天批培养过程中细胞生长,生产力和糖基化的变化。通过查阅培养基补充剂相关文献并选择足够高的浓度以对核心岩藻糖基化,末端半乳糖基化和活细胞密度(VCD / 滴度产生特定影响,选择2FP ,尿苷和半乳糖的浓度(15 17 18 )。我们还分析了糖基化途径蛋白(包括糖基转移酶和核苷酸糖供体转运蛋白)的基因表达数据,以确定所选补充剂如何影响细胞和蛋白质修饰的机制。

结果与分析

1. 细胞生长特性及代谢产物分析

如第2节所述,产生IgG1的悬浮CHO细胞在37°C下进行批培养。在每种实验设计条件下,细胞都遵循典型的生长行为,并且每种培养条件下VCD峰值在2.94.3×10 6 cell/ml 之间。在第7天的批处理结束时(图1S1)。相对于未添加补充剂组,在存在50μM2FP100 mM半乳糖的情况下生长的细胞没有表现出明显不同的生长行为(图1ab),但是200μM尿苷的补充导致从第4天开始一直维持较高的VCD水平直至第7天培养终止(图1aD4p = .017D7p = .003)。此外,与未添加补充剂相比,补充了尿苷的细胞的VCD峰值提高了23%。在每种实验条件下,整个批次中的葡萄糖和乳酸浓度均受到监测(图2a–c)。相对于未补充的对照,补充2FP不会显着影响葡萄糖或乳酸分布。然而,从第0天到第2天,添加了尿苷的培养物相对于未添加对照的葡萄糖消耗率略有降低,从第4天到第7天,添加了半乳糖的摇瓶显示了葡萄糖消耗率的变化。乳酸浓度显着低于第2天和第4天未补充的对照组(D2p = .0007D4p = .0003),并且在第7天终止培养时仍低于未补充对照组的乳酸浓度(p = .16)。

用于靶向调节单抗半乳糖基化和岩藻糖基化的培养基补充剂

1 补充培养基对活细胞密度(VCD )的主要影响。(a )补充尿苷(粉红色实线)相对于未补充对照(紫色虚线)显示VCD 增加;b )与未添加对照(红色虚线和蓝色虚线)相比,添加半乳糖或2FP (分别为橙色和绿色实线)对VCD 的影响最小。符号代表测量值,误差线代表±95 %置信区间(n = 8 )。2FP 2-F- 过乙酰基岩藻糖。

用于靶向调节单抗半乳糖基化和岩藻糖基化的培养基补充剂

2 补充剂对葡萄糖和乳酸的主要作用。a )补充2FP (绿色实线)与未补充对照(蓝色虚线)中的葡萄糖和乳酸浓度存在微小差异;(b )补充尿苷(粉红色实线)与未补充尿苷(紫色虚线)相比,乳酸水平有较大变化,而葡萄糖消耗量则相对不变;(c )在半乳糖补充(橙色实线)与未补充对照(红色虚线)中观察到葡萄糖和乳酸浓度的微小差异。符号代表测量值,误差线代表±95 %置信区间(n = 8 )。

2. 滴度分析与细胞产量

在第4天和第7天,在每种补充组合中培养的细胞滴度与未补充对照相比没有显著变化(3a;D4, p = .18;D7, p = .18)。但是,每种补充尿苷的培养物在第7天的单位生产力(pg /cell/day)都显着低于未补充尿苷的对照组的单位生产力(降低约50%;图3bp <.05)。培养基添加对滴度的主要影响如下:在存在50 µM 2FP100 mM半乳糖的情况下,与未添加对照的培养基相比,培养第4天和第7天的滴度没有明显变化(2FPD4p .65D7p 0.24;半乳糖:D4p 0.44D7p 0.59)。但是,在存在200μM尿苷的情况下,与未补充的培养物相比,滴度在第4天下降了34%,在第7天下降了30%(尿苷:D4p = 0.01;D7p = 0.005;3cd

用于靶向调节单抗半乳糖基化和岩藻糖基化的培养基补充剂

3 补充培养基后进行滴度和生产率分析。(a )在第4 天和第7 天,按照第2 节中所述用LC 测量的每种补充组合的滴度。(b )表1 中所述每种补充条件的比生产率(Qp ,滴度/ VCD / 天)。与上面指示的控制条件之间的差异(* p <.05 )。(c )尿苷对补充(粉红色实线)和未补充(紫色虚线)之间的滴度的主要影响;(d )半乳糖和2FP 对整个培养物中效价的主要影响。a )和(b )的误差线表示生物学重复的范围(n = 2 ),(c )和(d )的误差线表示存在指定补充剂时的±95 %置信区间(n = 8 2FP 2-F- 过乙酰基岩藻糖; LC ,液相色谱;VCD ,活细胞密度。

3. 多糖分析:半乳糖化和岩藻糖基化

如第2节所述(图4S5),通过裂解的聚糖分析和UPLC测定,未经补充产生的抗体具有典型的第7天糖谱的Fc-糖基化。这些培养物中的糖型包括丰度约为74%的G0F峰,总岩藻糖基化率为90%,总半乳糖基化率为16%,并且没有可检测到的甘露糖-5末端糖或唾液酸(图S3)。与第7天的对照摇瓶相比,添加半乳糖的培养物产生的抗体的G0聚糖相对丰度降低21%,同时G1G2聚糖相对增加。此外,在第4天和第7天之间,G0聚糖相对丰度增加未接受半乳糖补充剂的摇瓶中平均减少5-10%。在添加半乳糖的摇瓶中,G0聚糖的相对丰度在第4天和第7天之间基本保持恒定。尿苷和2FP的添加均显着影响相对抗体的半乳糖基化,但其作用远小于半乳糖。补充2FP导致相对半乳糖基化减少4%,尿苷增加2%。2FP和半乳糖之间的相互作用也显着影响D7半乳糖基化(p<.05),但该作用远小于单独半乳糖的主要作用。

用于靶向调节单抗半乳糖基化和岩藻糖基化的培养基补充剂

4 在批次的第4 天和第7 天从所有补充剂组合获得的抗体的半乳糖基化和岩藻糖基化;(a )在第4 天和第7 天每种补充剂组合的抗体半乳糖基化;(b )第4 天和第7 天每种补充剂组合的抗体岩藻糖基化。误差线表示生物学复制的范围(n = 2 )。2FP 2-F- 过乙酰基岩藻糖。

本研究中的三种补充剂均显着影响抗体岩藻糖基化(p <.05)。在培养基中添加50μM 2FP时,单克隆抗体相对集中程度的变化最大,在补充瓶和对照瓶中,第4天和第7天,单克隆抗体的相对集中程度下降了48%。虽然变化不如添加2FP的样品中观察到的变化大,但在存在200μM尿苷的情况下产生时,第4天和第7天的相对抗体岩藻糖基化下降了约7%,而添加100mM半乳糖会使岩藻糖基化增加约5%。另外,在所有补充条件下,岩藻糖基化的相对百分比在第4天和第7天之间没有变化。2FP,尿苷和半乳糖之间可能的双向和三向相互作用均显着影响第7天的岩藻糖基化(p <.05),但与单独使用2FP的主要作用相比,相互作用的作用很小。

4 .基因表达分析

每种补充剂都会改变关键糖基转移酶和其他糖基化相关基因的信使RNAmRNA)表达水平。如第2节所述,在第4天和第7天收获细胞样品,并提取mRNA并进行分析。与第4天未补充的对照相比,200μM尿苷补充可显着增加MGAT1B4GALT1B4GALT2B4GALT3B4GALT4B4GALT5B4GALT6SLC35A3(尿苷二磷酸[UDP]-N-乙酰基-D-葡萄糖胺[GlcNAc]转运蛋白)(p <.05)(图5S4)。在第4天,在存在100 mM半乳糖的情况下生长的细胞显示MGAT2MGAT5B4GALT3-4的表达发生了显着变化(p <.05)。在50μM处补充2FP导致MGAT5B4GALT1B4GALT4B4GALT5B4GALT6FUT8表达以及包括SLC35A3SLC35A2UDP-Gal转运蛋白)和SLC35C1(鸟苷)在内的多种核苷酸糖供体转运蛋白基因显着下调(p <.05)。表3总结了2FP,尿苷和半乳糖对第4天基因表达的影响。表3总结了2FP,尿苷和半乳糖对第4天基因表达的影响。相对于未补充的对照,补充剂对基因表达的影响较小(图S4),可能是因为补充剂和其他培养营养素的消耗,因为随着批次接近终止,细胞的新陈代谢和生产力会降低。

3 补充剂对关键糖基转移酶基因表达的影响

用于靶向调节单抗半乳糖基化和岩藻糖基化的培养基补充剂

数字表示平均值±SD。灰色方格表示与对照相比,表达量有显著差异。

用于靶向调节单抗半乳糖基化和岩藻糖基化的培养基补充剂

5 单个补充剂对第4 天的基因表达的影响;a )半乳糖,尿苷和2FP 的倍数变化基因表达差异;(b )半乳糖,尿苷和2FP 在被测基因第4 天表达水平的显著性分析,由因子分析的p 值表示(白色= p> .05 ,浅红色至深红色= p <.05 )。2FP 2-F- 过乙酰基岩藻糖。

讨论

1.尿苷

在这项研究中,我们描述了三种不同的培养基添加剂(尿苷,半乳糖和2FP)对细胞生长,mAb滴度和糖型分布的影响。与未补充尿苷的培养物相比,补充尿苷的培养物VCD显著升高(23%),滴度显著降低(30%),这可能是由于细胞增殖导致营养不足所致。这些结果不同于以前的报告,该报告显示滴度随着VCD的增加而增加(1819)。但是,这些研究中使用的尿苷浓度比此处检查的尿苷浓度高2.5-100倍,这可能是观察到的差异的原因。与对照组相比,补充尿苷的细胞从第0天到第2天的葡萄糖消耗率较低。观察到的VCD升高,滴度降低和葡萄糖代谢差异与尿嘧啶直接作为嘧啶从头和补救合成途径生物合成的底物的直接可用性是一致的,从而可以降低能源上昂贵的细胞分裂(23)。尿苷也是UDP糖合成的直接底物,该糖被合成并运输到高尔基体中,以在抗体和其他糖蛋白上建立聚糖结构(7)。与该观点一致的是,添加尿苷可显着增加MGAT1-2B4GALT1-6SLC35A3的表达(图6),这些都是糖成熟的关键酶,因为蛋白质横穿高尔基体(7)。MGAT12是构建最常见的mAb聚糖G0G0F的关键酶,它们各自在一个三甘露糖核心的末端分别添加了UDP-N-乙酰基葡糖胺糖。B4GALT1-6对使用UDP-Gal作为底物添加末端半乳糖残基至关重要。在第4天,补充尿苷的细胞显示以UDP糖为底物的酶的表达上调(MGAT1-2B4GALT1-6),这可能表明存在正反馈回路,这是由于存在尿苷导致UDP糖可用性更高所致(图6)。然而,与半乳糖和2FP补充引起的聚糖分布变化相比,上调这些酶的表达仅略微改变了糖基化谱。该结果表明,UDP用于核苷酸糖合成以及MGAT1-2B4GALT1-6的表达并不构成通过高尔基体正常糖类成熟的明显瓶颈。与在非补充培养物中产生的抗体相比,在200μM尿苷存在下生长的细胞中产生的抗体表现出抗体岩藻糖基化减少6%,半乳糖基化增加2%。由于尿苷对糖基化的影响很小,因此可用于对抗体岩藻糖基化和半乳糖基化产生轻微的影响。由于添加尿苷会导致较低的滴度,并且对抗体聚糖分布的影响很小,因此除非将其对VCD的影响以不牺牲抗体产量的方式加以利用,否则200μM尿苷不会被视为培养基补充的强力候选者。通过增加使用的尿苷浓度(18,19)。然而,简单地增加尿苷可能会产生负面影响,因为在尿苷浓度等于或高于10 mM的情况下生长的细胞会抑制细胞生长(18; 21)。

2.半乳糖

与未补充培养物相比,从第4天到第7天,补充有半乳糖浓度为100 mM的细胞显着减慢了葡萄糖的消耗。由于葡萄糖和乳酸变得不易获得,半乳糖的浓度在补充培养物中的整个培养过程中都很高(图S2),可能通过将半乳糖差向异构化为葡萄糖-1磷酸盐而成为补充培养物的能源。

通过Leloir途径(24)。由于添加了半乳糖,在这里观察到的由半乳糖补充引起的抗体半乳糖基化的变化(补充细胞中的G1 / G2聚糖多多达21%)已经报告了(1817)。半乳糖直接影响高尔基体中半乳糖基转移酶的底物利用率。有趣的是,添加半乳糖的烧瓶中的抗体半乳糖基化在第4天到第7天基本保持不变。相比之下,在缺乏半乳糖补充的烧瓶中,第4天和第7天之间的G0聚糖含量增加了5-10%,这可能是因为降低了葡萄糖水平具有有限的用于制造半乳糖的底物的细胞;半乳糖基转移酶的这种半乳糖可用性降低导致相对的抗体半乳糖基化程度降低。半乳糖补充的细胞MGAT2B4GALT3-6的表达上调,这具有两个作用:(a)能够接受末端半乳糖残基的聚糖的可用性增加;以及(b)将UDP-Gal添加到细胞中的酶的可用性增加。成熟的糖型(图6)。由于在半乳糖补充的摇瓶中,抗体半乳糖基化从第4天到第7天保持不变,因此第4天的测量可以预测性地告知生产批次中运行结束时糖型的分布,从而能够以补充剂驱动的方式改变抗体半乳糖基化而不会影响产量,细胞代谢或生长行为。

用于靶向调节单抗半乳糖基化和岩藻糖基化的培养基补充剂

6 2FP ,半乳糖和尿苷对糖基化以及细胞质和高尔基体之间其他关键途径的作用示意图。50 μM2FP (绿色)的存在会影响GDP 从头开始的岩藻糖合成,岩藻糖基转移酶活性,表达以及GDP 的岩藻糖转运蛋白的表达。补充有100 mM 半乳糖(橙色)的培养物可增加抗体半乳糖基化的底物利用率,还可通过Leloir 途径提供能量。补充200 μM 尿苷(粉红色)可增加负责将GlcNAc Gal 糖添加到抗体聚糖中的糖基转移酶的表达,并激活糖以用于糖基化和代谢。此外,尿苷是嘧啶生物合成中准备细胞分裂的底物。2FP 2-F- 过乙酰基岩藻糖; GDP ,鸟苷二磷酸;GlcNAc N- 乙酰基-D- 葡萄糖胺;UDP ,尿苷二磷酸。

3.2FP

尽管对抗体岩藻糖基化有重大影响(最多减少48%),但补充2FP并没有显着影响细胞生长,代谢或效价。另外,在补充和未补充的摇瓶中,岩藻糖基化水平在第4天和第7天之间保持相对恒定,这证明了在整个培养期间抗体岩藻糖基化对营养耗竭的鲁棒性。尽管添加2FP导致MGATB4GALT酶表达发生变化,但最有趣的是,它降低了负责UDP-GlcNAcUDP-GalGDP-FucTFUT8和转运酶(SLC35A3SLC35A1SLC35C1;图6)。2FP是岩藻糖可渗透细胞的氟化类似物,可在细胞内转化为GDP-2FP。与GDP岩藻糖相似,GDP-2FP被运到高尔基体,在那里它直接抑制FUT8,这种抑制作用说明了用2FP处理的培养物中抗体岩藻糖基化的减少(25)。另外,由于细胞无法利用GDP-2FP,因此会积累,并且其存在会抑制GDP-岩藻糖的从头合成。有限的GDP-岩藻糖可作为GDP-岩藻糖转运蛋白和FUT8的底物,可能在第4天导致这些基因的下调(图6)。在存在50μM2FP的情况下,相对岩藻糖基化在第4天到第4天是稳定的。第7天表明,在这种浓度下GDP岩藻糖的从头合成不会被完全抑制。另外,从第4天到第7天,营养的消耗似乎并未显着影响抗体岩藻糖基化,因为在有和没有2FP或其他补充剂的情况下,每个样品的相对岩藻糖基化保持稳定。

我们在这里观察到的对2FP添加的敏感反应在其他细胞系和培养基配方中可能有所不同。确实,Mishra等(16)观察到在存在50μM2FP的情况下产生的抗体的核心岩藻糖基化减少了60%,Ehret等人(26)观察到补充800μM2FP时减少了75%。2FP效应在不同浓度下的变化可能是由于培养基配方差异和CHO细胞异质性引起的。但是,即使效应的总体大小在生物过程之间有所不同,但与已知的过程或预测模型配对使用时,以不同的浓度或定时补充使用2FP可能是控制抗体岩藻糖基化的有效方法。影响细胞生长,代谢或抗体产量。由于半乳糖的存在对半乳糖基化有直接影响,而对岩藻糖基化的影响最小,反之亦然,对于2FP,这些补充剂提供了一种相对便宜的方法,可直接在产生mAb的生物过程中直接控制关键糖基化特性。培养中,直接使用半乳糖和2FP可以增加分批补料过程中产生的抗体的末端半乳糖基化并降低核心岩藻糖基化。2FP,尿苷和半乳糖在所使用的浓度下均未显示出生长抑制作用,因此,在接种后补充这些补充剂仅是为了调节最终的糖型,并且会增加补料策略的复杂性。即使在200μM尿苷存在下培养的培养物降低了第7天的滴度,但如果不进行接种后尿苷补充,则更长的运行时间可能会在运行早期提高细胞密度,并可能在14天的分批进料过程中证明了更高的后天生产率。在第7天,最初补充了100 mM的培养物中半乳糖仍然丰富。因此,我们预计在分批补料过程的整个过程中进料葡萄糖,半乳糖可能会在培养结束前保持可用状态,因此,半乳糖对末端半乳糖基化的影响仍然是可以预期的。在存在50μM2FP的情况下产生的抗体的核心岩藻糖基化从第4天到第7天是恒定的,如果2FP没有降解,则其作用应一直存在直到培养终止。

总结

将基因表达分析与整个培养过程中的标准测量相结合,如VCD、滴度和糖聚糖分布,提供了对培养基补充效应的生理洞察。同时我们对关键基因进行了有针对性的分析,一种更广泛的组学方法将提供更多关于转录组、代谢物和底物可用性之间相互作用的信息确定影响培养生长、蛋白质生产和糖聚糖分布的瓶颈(27)。这些方法的主要局限性是需要深入的经验智力探测后确定潜在的重要因素。一种集成的方法包括像我们这样的有针对性的实验探针和组学方法,将加速生物制药工艺的改进这一过程。

原文来源:

Evan Wells , Liqing Song , Madison Greer ,et,al.Media supplementation for targeted manipulation of monoclonal antibody galactosylation and fucosylation.Biotechnol Bioeng. 2020 Jul 14. doi: 10.1002/bit.27496.

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