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11月17日

靶向HBV cccDNA的CRISPR/Cas9体内递送系统的开发

作者 : admin | 分类 : 生物医学 | 超过 8 人围观 | 已有 0 人发表了看法
原标题:靶向HBV cccDNA的CRISPR/Cas9体内递送系统的开发

摘要

由于共价闭合环状DNA(cccDNA)的持续存在带来的难以治愈,慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染仍是全球一大卫生问题。CRISPR/Cas9基因编辑技术在基因治疗方面极具潜力,但该技术的临床应用需要有效的递送系统。该研究作者设计了16条HBV特异性的向导RNA(gRNA),并分别以慢病毒(LVs)及腺相关病毒(AAVs)为载体对其中3种候选gRNA/Cas9的递送效果进行了探究。这些gRNA/Cas9能在细胞中显著抑制HBV复制,其中WJ11/Cas9的效果最为显著,并被选取进行体内研究。AAV2-/WJ11-Cas9能显著抑制被测细胞HBV复制并降低其cccDNA含量。在人肝嵌合小鼠模型中,AAV2-/WJ11-Cas9可在不伴随明显细胞毒性的同时显著抑制HBcAgHBsAg、HBV DNA载量及肝组织cccDNA含量。该研究首次在HBV的自然感染模型中评估了CRISPR/Cas9系统的有效性及安全性,认为通过AAV2递送的WJ11/Cas9能清除HBV感染,为慢性HBV感染提供了新的治疗策略。

靶向HBV cccDNA的CRISPR/Cas9体内递送系统的开发

1.HBV特异的gRNA/Cas9系统筛选

靶向HBV cccDNA的CRISPR/Cas9体内递送系统的开发

图 1 靶向HBV基因组gRNA的筛选及切割效率评估。

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该研究筛选了16种靶向基因型C型HBV基因组不同区域的gRNA(图1A),将其在含hspCas9序列的载体中表达,并通过HBV-NanoLuciferase(HBV-NL)报告质粒对其靶向性进行评估(图1B),根据gRNA/Cas9的切割效果,研究人员选取了效果最为显著的WJ11 gRNA进行后续研究,并选取WJ10及WJ12作为对照。

2.以AAV2为载体递送的gRNA/Cas9系统抑制HBV DNA

由于慢病毒载体在临床研究中的局限性,该研究评估了相对安全的AAV2载体递送的WJ10/Cas9,WJ11/Cas9,WJ12/Cas9系统对HBV复制的抑制效果。由于外源基因在AAV载体的克隆上限长度为4.7kb,研究者将Cas9基因分为两部分:Cas9-up和Cas9-down,并将gRNA序列克隆进pAAV-Cas9-down载体,然后进行共感染。

侵染后3天及6天,相较于GFP对照,WJ10/Cas9、WJ11/Cas9和WJ12/Cas9均能够在感染复数(MOG)为2 × 10 和2 × 10 时显著抑制HepG2.2.15细胞及其培养上清中的HBV DNA水平(图2A-2D)。其中,侵染后3天,WJ11/Cas9在MOG为2 × 10 和2 × 10 时对胞内HBV DNA的抑制效果分别为18.8%和23.5%,对培养上清HBV DNA的抑制效果分别为15.7%和20.4%(图2A,2B);侵染后6天,WJ11/Cas9对胞内HBV DNA的抑制效果分别为46.1%和71%,对培养上清HBV DNA的抑制效果分别为17.2%和43.2%(图2C,2D)。且AAV2对细胞无显著影响(图2E,2F)。

靶向HBV cccDNA的CRISPR/Cas9体内递送系统的开发

图 2 AAV2递送的gRNA/Cas9在不同MOG下对HBV复制的影响。

3.以AAV2为载体递送的gRNA/Cas9系统抑制HBV cccDNA及HBsAg

侵染后6天,WJ10/Cas9和WJ11/Cas9能够在感染复数(MOG)为2 × 10⁴、2 × 10⁵和2 × 10⁶ 时显著抑制HBV cccDNA水平(图3A),其中WJ11/Cas9对HBV cccDNA的抑制效果在三种MOG下分别达到了10.5%,45.0%和60.6 %,呈现出剂量依赖性(图3B)。除cccDNA外,AAV2-gRNA/Cas9还能显著抑制上清HBV HBsAg水平。

靶向HBV cccDNA的CRISPR/Cas9体内递送系统的开发

图 3 不同MOG下AAV2/Cas9对HBV cccDNA的抑制效果。

4. 恩替卡韦与AAV2-/WJ11-Cas9联合处理对HepG2.2.15细胞中HBV复制的影响

恩替卡韦(3.75nM)联合AAV(MOG=2×10 )能够在处理后三天进一步抑制HepG2.2.15细胞的HBV DNA及cccDNA水平,恩替卡韦和AAV联合处理不会显著改变细胞的活性(图4)。

靶向HBV cccDNA的CRISPR/Cas9体内递送系统的开发

图 4 恩替卡韦与AAV2/WJ11-Cas9联合处理对HepG2.2.15细胞中HBV复制的影响。

5.AAV2-/WJ11-Cas9在人肝嵌合鼠模型的抗HBV效果

为了验证AAV2-WJ11-Cas9在HBV自然感染模型体内的抗HBV效果,研究者向HBV持续感染的人肝嵌合小鼠尾静脉注射AAV/WJ11-Cas9(1012 copies/mouse),发现尽管对照组小鼠血清HBV DNA水平持续上升,注射AAV/WJ11-Cas9组小鼠HBV DNA水平被显著抑制(图5A),AAV/WJ11-Cas9注射不引起小鼠ALT(图5B)、白蛋白(图 5C)及体重(图5D)的显著改变。此外,研究人员还发现AAV/WJ11-Cas9还能显著抑制人肝嵌合小鼠肝组织HBV DNA及cccDNA水平(图5E,5F)。此外,AAV/WJ11-Cas9还显著抑制了肝细胞中HBcAg和HBsAg的表达,阳性肝细胞比例从超过20%降至低于10%(图5G)。 检测肝内AAV载体基因组发现AAV/WJ11-Cas9的转导效率约为3.2%(图5H)。未在注射AAV的人肝嵌合小鼠肝细胞基因组发现特异的插入/缺失突变。

靶向HBV cccDNA的CRISPR/Cas9体内递送系统的开发

图 5 AAV2-/WJ11-Cas9在HBV持续感染的人肝嵌合鼠模型中的抗HBV效果。

总结

尽管HBV疫苗已取得很大成效,但HBV感染仍是一大世界卫生问题。此外,HBV在逆转录过程中可能发生的突变事件,增加了患者对核苷/核苷酸类药物的耐药风险,因此目前仍需开发新的抗病毒疗法来治愈慢性HBV感染。CRISPR/Cas9是一项可用于基因编辑及基因治疗的新型技术,但该技术在临床的应用需要安全、有效的递送系统。本研究利用HBV的体外及体内感染模型评估了CRISPR/Cas9系统治疗慢性HBV感染的安全性及有效性,发现经AAV递送的CRISPR/Cas9系统能为HBV感染提供新的治疗策略。

片警微述评

近年来,我国虽然在HBV性感染预防方面取得了极大的成就,但由于感染后cccDNA在肝细胞的稳定持续存在使感染一旦慢性化很难发生自发清除,我国仍有近八千万的慢性HBV感染者,近三千万的慢性乙肝患者。同样由于cccDNA的难以清除,现有抗病毒治疗手段均难以实现以表面抗原阴转为指标的临床治愈。这样,靶向病毒复制模板的cccDNA成为新药研发的热点。

CRISPR/Cas9基因编辑技术给整个医学和生命科学研究带来了革命性的变化,Emmanuelle Charpentier和Jennifer A Doudna两位学者也因其在该领域原创性的工作获得了今年的诺贝尔化学奖。自张锋博士首次报导CRISPR/Cas9系统可在哺乳动物细胞实现基因编辑以来,人们对该编辑系统在人类疾病诊疗中的应用充满了期待。来自宝岛台湾的陈培哲教授和我们团队是最早尝试将CRISPR/Cas9基因编辑系统用于靶向清除HBV cccDNA的两个实验室。在我们的早期研究中,虽然CRISPR/Cas9系统能够特异性地靶向结合并实现对DNA序列的精确切割,诱导靶DNA双链发生断裂。然而由于哺乳动物细胞的超强非同源末端连接(NHEJ)紧急修复系统,这种切割后形成的双链DNA断裂将被被细胞快速修复。为了阻滞cccDNA切割后被再次环化,我们曾率先采用了双gRNA切割使cccDNA碎片化的策略(WJG,2015;Theronostics, 2017)。PARP1是一种抗重组因子,可在DNA链发生断裂时减少异常重组发生。在刚刚举行的AASLD会议上,来自日本Osaka大学的Kazuhiro Murai等科学家采用CRISPR/Cas9联合敲减PARP1,或使用PARP1抑制剂以提高切割清除cccDNA的有效性并获得成功 (推文链接) 。

高效、安全的靶向递送系统是制约CRISPR/Cas9系统临床应用的主要障碍之一。考虑到AAV载体的相对安全性及某些血清型AAV的肝细胞嗜性,该研究无疑有其潜在价值。从作者的描述中有一项值得关注的现象,就是他们在肝细胞人源化的小鼠实验中 检测肝内AAV载体基因组发现AAV/WJ11-Cas9的转导效率约为3.2%(图5H),但HBV 标志物阳性的肝细胞的比例从超过20%降至低于10%(图5G)。这一结果意味着切割效率超过了介导CRISPR/Cas9编辑的AVV载体系统所感染的肝细胞数量。我们在早期实验中同样注意到了这一现象,并由此发现了外泌体能够介导gRNA和Cas9蛋白的细胞间传递、实现对非CRISPR/Cas9表达细胞内HBV DNA的切割(SMALL,2019)。

总之,CRISPR/Cas9基因编辑系统为靶向cccDNA的抗乙肝病毒治疗带来了希望,但真正用于临床尚有很远的路要走,并仍将面临很多的挑战。让我们共同努力,唯有实干才能真正将肝炎大国的帽子甩到太平洋里去!

文献来源

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