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11月15日

戊型肝炎病毒与宿主细胞相互作用研究进展

作者 : admin | 分类 : 生物医学 | 超过 8 人围观 | 已有 0 人发表了看法
原标题:戊型肝炎病毒与宿主细胞相互作用研究进展

摘要

戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus,HEV)是全世界范围内人类急性病毒性肝炎的主要病原体,但我们对HEV感染引起疾病的肝脏病理学及其致病机制依然知之甚少。宿主细胞与病毒蛋白间的分子相互作用是在病毒生命周期中决定病毒宿主范围及其发病机制的重要因素。该综述主要总结了目前科学界对HEV与宿主细胞相互作用机制的了解,并介绍了开展相关研究的实验策略、技术,以及鉴定与HEV相互作用的新型宿主细胞因子的方法。了解HEV与宿主细胞间的相互作用,可以帮助我们更好地了解HEV的生命周期,并可能进一步发现新的治疗策略和抗病毒药物靶点。

戊型肝炎病毒与宿主细胞相互作用研究进展

HEV被归类于戊型肝炎病毒科。目前,已有8种不同基因型的HEV被发现,其中基因1、2、3、4和7型HEV均可感染人类。基因1型及基因2型HEV仅感染人类,主要存在于发展中国家,通过粪-口途径引起水源性暴发。而基因3型、4型及7型HEV则为人兽共患病原体,具有更广泛的宿主范围,常在发达国家中导致偶发的人兽共患戊型肝炎。

HEV的基因组包括3个开放阅读框(Open Reading Frames,ORFs),ORF1编码非结构蛋白,包括甲基转移酶、木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶、解旋酶和RNA依赖性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)等;ORF2编码衣壳蛋白;ORF3编码在病毒颗粒组装和释放中起到重要作用的小型多功能蛋白质。近期研究表明,基因1型HEV还可表达另一个ORF4蛋白,如图1所示。HEV生命周期的许多方面及决定感染结局的病毒-宿主相互作用依然不甚清晰。近期对鼠HEV的研究显示,这种属于正戊肝病毒C属的病毒也可感染免疫健全的患者并引起严重的肝炎症状。这种具有人兽共患潜力HEV的发现更加强调了研发HEV新治疗策略的迫切性。

戊型肝炎病毒与宿主细胞相互作用研究进展

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图1 HEV基因组,及与HEV相关的宿主相互作用因素。HEV基因组能够编码3个开放阅读框(ORF):非结构多聚蛋白ORF1(红色)、衣壳蛋白ORF2(绿色)和具有离子通道并与病毒释放相关的小型多功能蛋白ORF3(蓝色)。ORF1多聚蛋白包括七个功能域,包括甲基转移酶、Y结构域、木瓜蛋白酶样蛋白酶、高变区(HVR)、X结构域、解旋酶和RNA依赖性RNA聚合酶。与病毒蛋白/结构或RNA直接相互作用的宿主因素在框中得以表示,并在表1中列出。宿主RNA序列能够插入病毒的HVR区域、可能的宿主蛋白酶切割位点包括Xa因子(黑色三角形)和凝血酶(绿色三角形)。

一般而言,病毒依赖于宿主的核酸、蛋白质和能量代谢,以确保自身的复制和长期存在。病毒蛋白常可干扰宿主细胞的信号传导途径或过程及其抗病毒防御机制;而病毒与宿主因素之间的相互作用则决定了病毒感染的过程及结局。因此,病毒的宿主嗜性主要由两个方面决定:宿主细胞对该病毒易感(表达病毒进入所需的受体),并支持该种病毒的复制。也正是因此,研究HEV及宿主细胞在感染过程中发生的相互作用对理解戊型肝炎的发病机理、开发抗病毒疗法至关重要。特别地,靶向HEV生命周期中所需宿主因素的替代治疗策略可能极大地减少耐药(或对药物不敏感)HEV毒株的出现。尽管HEV病毒宿主广泛且有多种新的实验动物模型(如慢性HEV感染的猪模型),但我们仍未在动物中鉴定出特定的宿主易感因素。本文将综述HEV生命周期不同阶段中病毒因素与人宿主细胞因素间的相互作用。

HEV感染过程中宿主细胞因素与病毒因素间的相互作用

病毒的附着和进入

病毒附着及进入宿主细胞是病毒感染周期中的起始步骤,且与病毒的宿主范围、组织嗜性和发病机制密切相关。病毒可附着于细胞膜上的特定成分,因此细胞的膜成分也决定了病毒的细胞嗜性。HEV是一种准包膜病毒,在胆汁和粪便中以无包膜病毒的形式存在,而在血液中的HEV则具有一层宿主来源的膜结构。已有多个研究证实,两种HEV通过不同的机制进入细胞。参与裸露HEV附着及进入细胞的宿主因素总结于图2及表1。通过共免疫沉淀(coimmunoprecipitaiton,CoIP)及酶联免疫吸附实验(ELISA)方法,可证实位于基底外侧膜上的细胞表面受体脱唾液酸糖蛋白受体1/2(asialoglycoprotein receptor 1/2,ASGPR1/2)的胞外结构域可直接与病毒的衣壳蛋白(ORF2)相互作用。ASGPR的表达可增强HeLa细胞与HEV的结合,其耗竭可减弱PLC/PRF/5细胞与HEV的结合,但不影响其释放;抗ASGPR抗体和其胞外结构域的竞争性抑制剂也可抑制无包膜HEV与肝细胞的结合。这些研究证实ASGPR可能通过与ORF2结合,促进HEV的感染。对PLC/PRF/5细胞系亚克隆的微阵列分析表明,整合素3α(integrin α3,ITGA3)是一种潜在的附着/进入因子,可观察到其与无包膜HEV直接相互作用,但应用ITGA3的抗体并不能抑制细胞系对HEV的准入。其在无包膜HEV进入细胞过程中的作用仍需进一步分析。使用重组表达核衣壳蛋白ORF2生成的病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)作为无包膜HEV模型的研究显示硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycans,HSPGs)、ATP合成酶5B(ATP synthase subunit 5β,ATP5B)以及葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)均在病毒的附着和进入过程中起到一定作用。而有包膜HEV(enveloped HEV,eHEV)的膜表面则不存在病毒蛋白,意味着eHEV可能不依赖附着因子或细胞受体进入细胞。已有研究证实,eHEV总体上与宿主细胞的附着效率较低,且与HSPGs或ITGA3无关。eHEV膜上还有磷酯酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS),其可能作为潜在的附着因子与细胞表面的T细胞免疫球蛋白黏蛋白结构域1(T cell immunoglobulin mucin domain 1,TIM-1)结合,该机制已在包膜富含PS的多种包膜病毒中发现。HEV病毒体以两种形式存在,这种特性是否影响其在宿主体内的存活、传播和组织嗜性尚不清楚。 鉴于HEV感染存在多种肝外表现,eHEV与细胞结合的较低特异性可能与HEV导致的肝外症状有关。总体而言,尽管多种宿主因子被发现与HEV的附着和进入相关,人们对不同宿主因素在感染过程中起到的确切作用仍知之甚少,且无包膜HEV进入细胞的受体依然未知。新的细胞培养体系、基因组筛选(结合cDNA、CRISPR和RNAi库)、深度测序和组学方法可推动对HEV受体的进一步研究。

表1 目前已知的与HEV直接相互作用的宿主因素

戊型肝炎病毒与宿主细胞相互作用研究进展

HEV的内化和脱壳

穿过细胞膜是建立HEV感染的第一步。eHEV的准包膜可以逃避抗体介导的免疫反应,但病毒仍然需要内化并进行基因组的脱壳。有/无包膜HEV的内化均涉及网格蛋白(clathrin)和发动蛋白(dynamin)依赖性途径,但已有研究显示病毒基因组在不同时间点发生脱壳。Rab5和Rab7的敲低均不会改变无包膜HEV的感染性,但会导致eHEV的感染性降低。一般认为,eHEV脂质膜的降解需要其向溶酶体的运输。与此一致地,溶酶体中降解脂质膜所需的各种酶,如NPC细胞内胆固醇转运蛋白1(Niemann–Pick C1 protein,NPC1)或溶酶体酸性脂肪酶(lysosomal acid lipase,LAL),均可选择性地降低eHEV的感染性。这种机制也在准包膜的甲型肝炎病毒(Hepatitis A Virus,HAV)感染过程中存在。从未感染细胞释放的非特异性细胞外囊泡则无法观察到其向溶酶体的运输,这一现象说明 eHAV(及类似的eHEV)膜上可能存在特定的能使被包裹的病毒颗粒靶向至溶酶体的信号。定量蛋白质组学方法的研究可以给这一假设提供更多支持。尽管有/无包膜的HEV在细胞内释放的时间和空间不同,但尚不清楚这一过程是否以不同机制发生。但如果去膜后的eHEV的核衣壳与无包膜HEV的核衣壳类似,都可与同一蛋白发生相互作用,则晚期内体溶酶体和早期内体均需要存在一种潜在的受体,在两者间运输。 可基于一种脱壳受体,研究新的治疗策略,以干预有包膜及无包膜HEV的复制。

HEV复制复合物

病毒的组装和释放

戊型肝炎病毒与宿主细胞相互作用研究进展

图2 HEV复制周期及其与宿主因素相互作用示意图。HEV以有包膜(eHEV)和无包膜两种形式存在,无包膜病毒颗粒附着于硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycans,HSPG),去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor,ASGPR)和整联蛋白α3(integrin alpha 3,ITGA3);有包膜HEV则通过含磷酯酰丝氨酸的膜与宿主细胞表面的T细胞免疫球蛋白粘蛋白结构域1(T cell immunoglobulin mucin domain 1,TIM-1)相互作用,附着于宿主细胞。有/无包膜的病毒颗粒均需要网格蛋白和发动蛋白依赖性机制内吞。HEV脱壳的相关机制仍不明确,但已确定的是两种形式的HEV需要不同机制进行脱壳。无包膜HEV颗粒在早期内体中进行脱壳,RNA基因组一般被认为通过病毒体及受体结合时形成的孔结构释放至细胞质。而eHEV需要通过Rab5阳性及Rab7阳性的晚期内体和溶酶体进行运输及脱壳。HEV的脱壳过程需要溶酶体的酸化、NPC细胞内胆固醇转运蛋白1(Niemann–Pick C1 protein,NPC1)和溶酶体酸性脂肪酶(lysosomal acid lipase,LAL),表明该过程需要降解病毒的脂质膜。正义RNA基因组首先被翻译为ORF1多聚蛋白,随后在RdRp的作用下产生一个负义链RNA,作为基因组和亚基因组RNA转录的模板,编码ORF2和ORF3蛋白。目前认为ORF2有几种不同的形态,其大小和糖基化状态不同,通过一种未知蛋白酶的水解切割作用(ORF2c)或替代翻译作用(ORF2s)形成较小的ORF2蛋白。此外,这两种形式的ORF2都可被未知的酶糖基化(ORF2g)。这三种修饰后的ORF2均可分泌至血液中,作为免疫诱饵。未经修饰的传染性ORF2(ORF2i,即ORF2衣壳蛋白)可自组装并形成病毒衣壳。ORF3可被未知的激酶磷酸化,使其与未修饰ORF2结合并促进病毒颗粒的释放。磷酸化的ORF3还可与肿瘤易感基因(tumor susceptibility gene 101,TSG101)结合,参与内体分选复合物(endosomal sorting complex required for transport,ESCRT)机制。TSG101是病毒高效释放所必需的,也可将病毒颗粒转运至多囊泡体(multivesicular bodies,MVBs)。此外,ORF3还可被未知的酶棕榈酰化,与ORF3的亚细胞定位和病毒颗粒的释放有关,MVBs可与质膜融合,随后可从基底外侧膜方向释放有包膜HEV或在从顶端膜释放病毒使其去除包膜。ssRNA,single stranded RNA,单链RNA。

HEV蛋白介导的宿主因子调节

通过宿主因素实现的PTMs在HEV病毒蛋白(如ORF2、ORF3)的功能调节中发挥了重要作用。近期还有研究发现了病原体编码的酶修饰靶细胞蛋白从而为其提供复制环境、逃避宿主免疫系统的机制。例如,由ORF1编码的多聚蛋白的不同结构域被证实可改变宿主细胞蛋白的PTMs。ORF1的X结构域(macro结构域)可起到去聚-ADP-核糖基化(de-PARylation)和去单-ADP-核糖基化(de-MARylation)酶的作用。单-ADP-核糖基化和聚-ADP-核糖基化作用可调控关键的生物学和病理学过程,如在委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus,VEEV)和严重急性呼吸系统综合症冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV)中可观察到病毒RNA的ADP-核糖基化,其被认为是启动细胞免疫应答的信号。VEEV和SARS-CoV编码的酶具有ADP-核糖基水解酶活性的结构域,可支持宿主细胞中的病毒复制。因此HEV的X结构域很可能干扰宿主细胞中的抗病毒反应,相似地,Met-PCP结构域可去除蛋白质上的泛素残基和干扰素刺激基因15(interferon-stimulated gene 15,ISG15)残基。ISG15是病毒感染后表达量上调最显著的的基因之一,是一种普遍存在的泛素样修饰因子,在抵御各种病毒中均可发挥作用。因此,去除ISG残基可为HEV提供免疫逃逸的优势,且HEV可阻断I-III型干扰素应答的不同ISGs的表达,但其机制尚不明确。

宿主细胞与HEV间的基因交换

由于病毒RdRp容易出错的特性,RNA病毒(如HEV)会多样化地进入内部变异性较高的宿主种群,以在不断变化的环境中为病毒种群提供便利。HEV基因组的ORF1中存在于HVR区,即使在相同基因型的分离株间,也可显现出较大的序列差异。近期有研究从急性HEV感染患者中发现了发生基因组重排的HEV毒株,且发现人群异质性的增强可能与HEV的持续感染和抗RBV作用相关。此外,两种含有人核糖体亚基(S17和S19)插入片段的HEV毒株(源自慢性HEV感染者的粪便样本)在细胞培养中复制能力更强,宿主范围也有所扩大。由小型RNA病毒(如HEV)的感染或复制所不需要的序列常迅速丢失可判断出HVR在HEV复制及发病机制中的潜在生物学作用。在不同病毒种,有两种病毒基因组的促进重组插入作用:即复制性的“复制选择”及非复制性的“断裂-连接”机制。HVR区域的插入可导致更多重组HEV的出现,基因序列的插入还可导致病毒的耐药性和感染的慢性化,对基因交换和可塑性的机制研究至关重要。

总结

HEV细胞培养体系的发展对HEV感染生物特性的研究至关重要。目前,HEV复制周期的许多步骤仍不清楚,虽已有多种进入/附着因子被发现,但仍不清楚不同因子与病毒间的具体相互作用,HEV进入宿主细胞的受体也依然未知。有/无包膜间的内体逃逸机制不同,类似地,其机制所需的蛋白也仅有一小部分被发现。已有研究显示ORF3的修饰对病毒的释放至关重要,但仍需要探明其修饰蛋白。同时,近期有研究显示,HEV的复制还需要未知的转录因子及翻译因子。新抗病毒治疗策略的研发将主要靶向病毒的基因组、蛋白质或与其相互作用的宿主因素,以干扰病毒的复制和传播。已有研究提及的蛋白及更多未知的宿主蛋白均可成为药物干预策略的潜在靶标,因此进一步阐明HEV的生命周期及其与宿主因素的相互作用对了解HEV的感染方式、对宿主细胞的劫持机制和确定新的药物靶点至关重要。

文献来源:

Wißing MH, Brüggemann Y, Steinmann E, Todt D. Virus-Host Cell Interplay during Hepatitis E Virus Infection [published online ahead of print, 2020 Aug 19]. Trends Microbiol. 2020;S0966-842X(20)30193-1. doi:10.1016/j.tim.2020.07.002

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