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11月10日

灌流培养技术可用于减少双特异性抗体的聚集形成

作者 : admin | 分类 : 生物医学 | 超过 8 人围观 | 已有 0 人发表了看法
原标题:灌流培养技术可用于减少双特异性抗体的聚集形成

治疗性双特异性抗体(BisAbs)表达的一项主要挑战是高比例聚体形成。聚体会增加患者免疫反应的风险,因此必须以牺牲产率为代价将其除去。BisAb含有工程二硫键,当其错配时会生成聚体。然而,导致聚体形成的潜在细胞内机制尚不清楚。本研究证明,谷胱甘肽调节受损是CHO细胞过程中BisAb聚体形成的基础。使用分批式补料培养和灌流培养,评估产生BisAb的同一克隆CHO细胞系其聚体形成情况。与分批式补料培养工艺相比,灌流培养过程产生了更低的BisAb聚体,减轻了线粒体功能障碍和内质网应激进而改善了细胞内氧化还原环境与氧化型谷胱甘肽比例。而补料分批式培养过程中,由于线粒体功能障碍引起的谷胱甘肽氧化和内质网应激破坏了细胞内的氧化还原稳态,导致产物形成聚体。综合来看,我们的结果表明线粒体功能障碍和内质网应激使得谷胱甘肽调节作用受损,导致补料分批式培养过程中的产物聚体比例更高。这是首次利用灌流生物反应器证明细胞内潜在的产物聚体形成的机制。

双特异性抗体(BisAbs)是一类单克隆抗体(mAbs),旨在识别两种不同的抗原,使其能够同时靶向多种途径1。在过去的几年中,BisAbs在临床上广泛地用于治疗多种人类健康疾病。根据在最近的一份报告中,正在考虑将85种以上的BisAb用于临床开发,其中大多数药物已被评估用于治疗癌症1。但是由于产量低,BisAb的开发和生产经常受到制造问题的挑战2。特别是,在BisAbs生产过程中观察到的一个常见挑战是由于工程二硫键配对不正确而导致的高产物聚集(在某些情况下超过40%)3-5。产物聚体会触发患者的免疫原性反应,因此必须将其清除,从而严重降低产品产量并增加商业生产成本。尽管产物聚体在细胞内形成,但减轻产物聚体的传统工艺开发策略集中在细胞外参数(pH,温度,DO等)上,实际上忽略了它们对细胞内环境的影响6,7。此外,最近的一项研究表明,与补料分批工艺相比,灌流工艺降低了产品的聚集水平8。然而,目前尚不清楚导致细胞内BisAb聚集体形成的基本机制,BisAbs含有工程化的二硫键以提高结构稳定性,这在以前曾涉及到BisAb聚集3。众所周知,分子间/分子间二硫键的形成是敏感的到细胞内的氧化还原状态。细胞内氧化还原环境主要受细胞内游离硫醇含量(半胱氨酸和谷胱甘肽)和活性氧(ROS)的影响。主要通过线粒体氧化磷酸化和内质网(ER)中的氧化蛋白折叠过程中的氧的部分还原,在细胞内不断产生ROS。由于大量的ROS产生和积累,氧化应激会破坏细胞结构和功能,最终影响细胞内氧化还原稳态。因此,对细胞内氧化还原环境与ER中二硫键形成之间耦合关系的基本理解对于减轻BisAb生产过程中产物聚体的形成至关重要。在这项研究中,我们利用补料分批和灌注过程作为工具来确定影响ERBisAb聚集体形成的潜在细胞内机制。我们的假设是,分批补料培养工艺比灌流培养更容易发生氧化应激诱导的异常氧化还原稳态随后导致更高的聚体形成。这是首次研究并在细胞内水平比较补料分批和灌注生物反应器,以了解有助于细胞内聚集形成的关键调节子的观点。因此,我们在分批补料和灌注过程中培养了产生BisAb的相同克隆CHO细胞系1620天。我们通过研究线粒体对ROS,细胞内谷胱甘肽水平和ER中蛋白质折叠的作用,比较了两个过程的细胞内氧化还原环境。简而言之,我们的数据表明分批补料生物反应器中较高的比生产率会导致线粒体功能障碍和内质网应激。线粒体功能障碍增加了细胞内ROS的产生,导致分批补料生物反应器中的谷胱甘肽过度氧化。不平衡的细胞内谷胱甘肽调节与内质网应激导致错误配对的二硫键形成,导致补料分批生物反应器中细胞内BisAb聚集体形成增加。相比之下,灌流培养减轻了线粒体功能障碍和内质网应激。线粒体功能障碍的缓解改善了细胞内谷胱甘肽的体内稳态,并减弱了错误配对的二硫键形成,从而减少了灌流生物反应器中细胞内BisAb聚体形成。

灌流培养增加了活细胞密度(VCD)并降低了单位生产率

通过用表达BisAb的相同克隆CHO细胞系运行分批补料式培养和灌流培养生物反应器来研究该假设。表1列出了这两种CHO细胞培养过程的过程条件。我们的数据表明,与分批补料过程相比,灌流培养过程将VCD峰值增加了三倍(图1A)。与分批补料生物反应器相比,灌流培养生物反应器在整个细胞培养过程中还保持了更高的CHO细胞活力(图1B)。在整个实验过程中,灌流培养生物反应器的每日滴度浓度(图1C)和细胞比生产率(图1D)明显低于分批补料生物反应器。但是,与分批补料培养过程相比,灌流培养过程中的累积滴度要高约2.5倍(9.0±0.2 g / l3.6±0.1 g / l)。先前的研究表明,培养基内较高的摩尔渗透压浓度对产生mAbCHO细胞系中的细胞生长和活力具有负面影响9。在我们的研究中,对于补料分批和灌流培养过程,培养基在第0天的初始摩尔渗透压浓度相同(图1E)。从第10天开始,补料分批生物反应器中的渗透压浓度开始增加,而在灌流培养生物反应器中,渗透压浓度保持恒定。在固定阶段,分批补料生物反应器的平均细胞体积相对高于灌流培养生物反应器,但是,我们没有观察到整个过程之间的细胞大小有任何显着差异(图1F)。分批补料和灌流培养生物反应器均具有良好的乳酸分布,峰值在<2 g/ L(图1G)。总之,与分批补料过程相比,灌注过程增加了VCD峰,维持了较高的细胞活力,并降低了细胞比生产率。

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1.分批补料培养和灌注培养的过程参数。使用分批补料或灌流培养过程表达BisAb的相同克隆CHO细胞系。方法在3升生物反应器中进行。以0.8×10 6 cells/mL 的密度接种细胞。

灌流培养技术可用于减少双特异性抗体的聚集形成

灌流培养技术可用于减少双特异性抗体的聚集形成

图1. 分批补料式培养和灌流培养生产BisAb的过程分析比较。每天从每个生物反应器中取样以测量(A)活细胞密度,(B)细胞生存力,(C)滴度,(D)比生产率,(E)摩尔渗透压浓度,(F)细胞体积和(G )乳酸浓度。

灌流培养减少BisAb的聚集形成

先前,灌注已经被证明可以降低产品聚集水平。因此,从生产的第6天开始分析细胞外(培养基上清液)和细胞内(细胞颗粒)聚体水平。在整个培养过程中,分批式补料过程中的产品的聚体水平明显高于灌流培养,(图2A,左图)。在间歇式补料生物反应器中,第6天和第15天的细胞外聚集水平分别为31.4±0.7%35.3± 1.6%(图2A,左图)。相比之下,灌流生物反应器在第6天和第15天的细胞外聚体分别为26.3±0.3%31.2±1.1%。两种细胞培养过程中的细胞外聚集物水平在培养的指数增长阶段增加。然而,在稳定期,在分批进料过程的聚集水平保持升高,而在灌注过程中聚集水平下降。我们还测定了培养基对细胞外BisAb聚集物形成的影响(补充图S1)。我们的数据表明,在分批进料和灌注培养过程中,前2天和4天内,培养基对细胞外BisAb聚集物的形成无显著影响。此外,我们还使用毛细管免疫印迹分析法测定了细胞外聚集物水平的相对变化(图2A,右图)。在非还原条件下,我们发现在第6天到第16天,分批进料过程中的聚集水平相对灌注进料较高。还原条件表明,二硫键的错配导致bisAb聚集体的形成(因为二硫键还原后只检测到游离HC)。接下来,我们通过westernblot在非还原和还原条件下分析了BisAb-IgG在细胞内积累的相对变化,以确定灌注对细胞内聚集物积累的影响(图2B)。非还原westernblot显示,在间歇式进料生物反应器中,细胞内聚集量从第6天到第16天显著增加,而在灌流生物反应器中,细胞内聚集物的积累仅略有增加。还原western印迹表明,BisAb在细胞内聚集是由于二硫键错配(因为在还原western印迹下仅检测到游离HC)。此外,尽管在灌注生物反应器中的表达水平比分批式生物反应器更低,但HC在这两个过程中都得到了很好的表达。总之,这些发现表明BisAb聚集体是由于二硫键的错误配对而形成的,并在细胞内形成和分泌。这一观察结果与先前报道的研究一致。此外,与分批进料过程相比,灌注过程显示细胞内聚集物的形成较低,导致上清液中的产物聚集物较少。

灌流培养技术可用于减少双特异性抗体的聚集形成

2. 分批补料式培养和灌流培养过程中BisAb 聚集体形成的分析。(A )左侧:从第6 天开始,从每个生物反应器中收集无细胞样品。通过超高效排阻色谱分析样品,以确定总BisAb 聚体的百分比。在细胞培养过程中,细胞继续分泌单体和聚体。右侧:在第6 9 14 16 天从分批补料式和灌流生物反应器中收集的无细胞样品通过毛细管Western blot 分析进行分析。在非还原(左侧)和还原(右侧)条件下测定培养基的聚体积累,BisAb HC 表达。(B )在第6 9 14 16 天从补料分批和灌注生物反应器中收集细胞沉淀。通过毛细管Western 印迹分析,在非还原(左侧)和还原(右侧)下,分析细胞内聚体的积累,BisAb HC 表达。

灌流培养保护CHO细胞免受ROS诱导的氧化损伤

细胞内氧化还原状态影响分子间和分子内二硫键的形成以及错配二硫键的还原和再氧化。细胞内氧化还原状态主要受氧化剂(ROS)和抗氧化剂(包括谷胱甘肽和半胱氨酸在内的游离硫醇)之间的平衡调节。ROS(例如过氧化氢(H2O2)和超氧阴离子(O2–·))通过酶和非酶机制不断在细胞内产生。细胞内ROS的不平衡积累破坏了氧化还原平衡,并可能影响二硫键的形成。因此,我们用流式细胞仪测定了分批进料和灌注式生物反应器中活细胞内ROS水平的相对变化。我们的结果表明,在指数生长阶段(第9天的MFI:13826±444vs.12518±190),分批补料和灌注生物反应器之间的ROS水平没有显著差异(图3A)。然而,在稳定生长期,灌注生物反应器的ROS水平显著低于分批补料生物反应器(第15天的MFI:6986±151vs 18337±355)。这些数据表明,灌注可以减轻细胞内ROS的积累。

铜、铁、锌、铅、锰等重金属离子也会影响细胞内氧化还原环境。此外,这些金属离子作为多种细胞内酶和抗氧化剂的关键辅助因子,有助于细胞内氧化还原平衡。由于氧化还原代谢受损,重金属离子在细胞内的过量积累可通过芬顿反应进一步增加ROS的生成,其中H2O2与金属离子相互作用,形成自由羟基自由基(OH-)。因此,我们接下来评估细胞内重金属离子的相对变化,以确定灌注是否对重金属离子的摄取有不同的影响。与ROS水平一样(图3A),在指数增长阶段,分批进料和灌注过程中细胞内重金属离子水平没有显著差异(图3B)。然而,在稳定生长阶段(第15天的MFI:584±33vs.476±6),分批补料生物反应器中的细胞内金属离子水平显著高于灌注生物反应器,这与我们在图3A中的发现的结果相一致。这些数据表明,在稳定生长期,灌注可降低重金属离子在细胞内的积累,从而降低灌注生物反应器中的细胞内ROS水平。细胞内ROS积累导致脂质膜过氧化、蛋白质氧化修饰和DNA损伤,最终导致结构功能丧失和细胞死亡。4-羟基壬醛(4-HNE)是一种细胞毒性反应性醛,作为脂质膜过氧化的副产物,与氨基酸残基形成蛋白质加合物,破坏蛋白质结构和功能。研究表明,30%4-HNE加合蛋白位于线粒体内,其中大部分是线粒体电子传递链的成员。因此,我们接下来分析了分批补料和灌注生物反应器中4-HNE蛋白加合物形成的细胞样本,作为ROS诱导氧化损伤的标志物。我们观察到,分批补料生物反应器从第3天到第16天,4-HNE加合物的形成增加了约两倍(图3C)。相比之下,在灌注过程中的形成在第3天到第14天,4-HNE加合物减少了3倍。总的来说,在整个细胞培养过程中,4-HNE加合物在灌流式生物反应器中的含量要低得多。

总之,这些数据表明,相对于灌注过程,分批补料过程中ROS水平升高,从而引发细胞氧化损伤。在分批补料过程中,细胞内活性氧积累增加,破坏了细胞内氧化还原平衡,促进了BisAb聚集体的形成。相反,灌注过程减轻氧化应激,保护了CHO细胞免受中度ROS诱导的氧化损伤。减轻灌注过程中细胞内ROS的积聚有助于改善细胞内氧化还原平衡,并减少BisAb聚集物的形成。

灌流培养技术可用于减少双特异性抗体的聚集形成

3. 分批补料式和灌流生物反应器之间的细胞内氧化应激比较。在指定的日期采集细胞样品,以确定(A )活性氧(ROS ),(B )重金属离子和(C 4-HNE 加合物形成的细胞内变化。(A B )左侧显示了第2 天和第15 天补料分批和灌注生物反应器的代表性直方图。右侧显示了来自重复生物反应器的平均荧光强度(MFI )。数据表示为平均值±SD 。(C )在左侧中显示了在补料分批和灌注生物反应器中形成4-HNE 加合物的代表性毛细管蛋白质印迹图像。FKBP12 (〜12 kDa )作为对照。数据在右侧中表示为4-HNE AUC / FKBP12 AUC

灌流培养可减轻线粒体功能障碍引起的ROS生成

线粒体产生的超氧阴离子(O2-·)是大多数ROS的前体。因此,我们测定了线粒体对细胞内ROS生成的贡献,并评估了线粒体生物能对BisAb聚集物形成的影响。除了通过氧化磷酸化产生ATP外,线粒体的生理功能还包括ROS生成和解毒。线粒体中抗氧化剂超氧化物歧化酶(SODs)催化O2–·产生过氧化氢。然而,氧化应激可损伤线粒体电子传递链(ETC)和线粒体膜,最终导致线粒体膜去极化。由于线粒体膜受损导致的质子泄漏增加了线粒体呼吸(非耦合呼吸),进一步增加了超氧物的产生。因此,为了评估灌注和分批投料过程对线粒体生物能学和线粒体O2-生成的影响,我们首先使用海马生物分析仪检查了质子流失引起的基础耗氧率(OCR)和非耦合呼吸(图4A)。在稳定期的早期,分批投料中CHO细胞的基础OCR和质子泄漏量均比灌注中的CHO细胞高两倍(第9天的基础OCR:67.4±1.7vs.37.8±2.6 pmol/min;第9天的质子流失:13.66±0.6vs.6.9±0.7 pmol/min)。在第1天和第5天的过程中,未观察到OCR或质子流失的显著差异。这些数据表明,在分批补料生物反应器中,基础OCR中间过程的增加可能是较高的比生产力和4-HNE诱导的ETC功能障碍的综合作用,因此,线粒体中连接呼吸和非耦合呼吸的ATP分别增加。另一方面,减轻ETC功能障碍和较低的比生产率(图1C)使灌注生物反应器中的细胞能够以较低的OCR满足其ATP需求,而不会损害线粒体。

接下来,我们比较了分批补料和灌注生物反应器的活CHO细胞中线粒体超氧物的产生。当氧与线粒体呼吸链的流失电子发生不适当的反应时,就会产生超氧化物。众所周知,线粒体功能障碍是线粒体产生过多超氧物的基础,增加了细胞对活性氧氧化损伤的脆弱性。我们的分析表明,与灌注过程相比,分批补料工艺产生的超氧物显著增加(图4B)。具体而言,与灌注生物反应器相比,在稳定生长阶段,分批补料生物反应器中的超氧物生成量高出1.5倍以上(第13天的MFI:772.5±7:509.5±14.5)。此外,我们还测定了线粒体膜电位(Δψm)的相对变化,以进一步了解分批投料和灌注过程如何影响线粒体健康(图4C)。在整个细胞培养过程中,与分批投料生物反应器相比,灌注生物反应器中的CHO细胞具有更高的培养潜力。这些数据表明,灌注过程减轻了线粒体超氧化物的产生,保护细胞免受线粒体氧化损伤和随后的膜去极化。

最后,为了进一步证实我们的发现,与灌注过程相比,分批补料工艺显著提高了超氧物的产生量(图4B)。我们研究了分批补料和灌流过程对细胞内线粒体中产生的抗氧化酶(SODs)的影响(图4D)。SOD1位于细胞质和线粒体膜间空间,其中超氧阴离子主要是由于电子传递链功能障碍产生的,而SOD2则位于线粒体基质中。我们的数据表明,在整个过程中,与灌注生物反应器相比,分批补料生物反应器中SOD1SOD2的蛋白质表达都更高,这与我们在图4B中的发现一致。具体地说,在分批补料生物反应器中,由于线粒体ETC功能障碍诱导的超氧物生成导致SOD1表达的显著上调,以保护线粒体免受的氧化损伤。在培养过程的稳定期,与灌注生物反应器相比,分批补料生物反应器显示SOD1表达增加了四倍多(图4D)。尽管SOD2在分批补料反应器中的表达较高,但分批补料反应器和灌注式生物反应器的SOD2的表达没有显著差异。

总的来说,这些数据表明灌注过程通过减少细胞ATP需求和减轻ETC功能障碍引起的超氧物的产生而提高线粒体寿命。线粒体超氧物生成的减轻,降低了线粒体对累积ROS产生,并减少了灌注生物反应器中BisAb的聚集。

灌流培养技术可用于减少双特异性抗体的聚集形成

4. 分批补料式和灌流培养过程中线粒体功能和超氧化物产生的分析。在指定的日期从每个生物反应器中获取细胞样品,以确定(A )基础耗氧量(OCR )和质子流失(B )线粒体超氧化物产生(C )线粒体膜电位和(D )超氧化物歧化酶表达(SOD1 :〜16 kDa SOD2 22 kDa )。汇总的海马和流式细胞仪数据表示为重复生物反应器(A C )的均值±SD D FKBP12 用作蛋白质印迹分析的上样对照。数据在右侧中表示为SOD AUC /FKBP12 AUC

灌流培养改善CHO细胞中谷胱甘肽的调节

细胞内氧化还原状态影响蛋白质折叠过程中二硫键的形成以及内质网中错配二硫键的还原和重组。细胞氧化还原电位主要受细胞内谷胱甘肽水平的调节。除了胞浆中的ROS解毒作用外,还原型谷胱甘肽转运到内质网是形成或减少二硫键的关键。在内质网中,氧化的谷胱甘肽驱动蛋白质二硫键异构酶(PDI)介导的二硫键的形成,而还原型谷胱甘肽维持PDI在还原状态并催化错配二硫键的还原。因此,还原性细胞质环境对于还原型谷胱甘肽转运至内质网、维持内质网氧化还原平衡以及确保因内质网应激而形成的错配二硫键的减少至关重要。当PDI通过接受来自半胱氨酸残基的电子来氧化蛋白质中的半胱氨酸残基时,就会形成二硫键(图7)。内质网氧化还原素1ERO1)然后通过将电子从PDI转移到分子氧形成H2O2来重新氧化PDI。因此,由于高比生产率,压倒性的折叠速率可触发内质网中过量的过氧化氢生成,进一步增大谷胱甘肽的氧化作用。为了确定分批补料和灌注过程如何影响细胞内谷胱甘肽和二硫键的形成,我们利用发光分析法评估了CHO细胞中还原型谷胱甘肽(GSH)与氧化谷胱甘肽(GSSG)的比率(图5A)。我们观察到,与灌注生物反应器相比,在稳定生长阶段,分批补料生物反应器中GSSG的相对胞内浓度大约高出5倍(第12天的GSSG浓度:1.07±0.04mM vs.0.192±0.07 mM)。这些数据表明,在稳定生长阶段,间歇式补料生物反应器中存在氧化的细胞内环境。此外,在灌注后的初始2天,灌注生物反应器中的GSSG水平显著降低。与分批补料法相比,灌注改善了GHS/GSSG比值(图5A右图),约提高了3倍。在间歇式补料生物反应器的整个过程中,我们没有观察到GSH/GSSG比值的任何显著变化。接下来,我们评估了分批补料和灌注过程是否由于不同的比生产率和聚集物而对PDI表达产生了不同的影响(图5B)。我们没有观察到分批补料和灌注生物反应器之间PDI表达的任何显著差异。总之,这些发现表明灌注过程的诱导提高了细胞内谷胱甘肽的比率,并保持了良好的细胞内氧化还原平衡。

灌流培养技术可用于减少双特异性抗体的聚集形成

5. 细胞内氧化还原状态的分析(A )在指定的日期从每个生物反应器中采集细胞样品,并通过测量细胞内谷胱甘肽浓度的相对变化来确定细胞内氧化还原状态。分批补料式和灌流生物反应器中氧化型谷胱甘肽(GSSG )的细胞内浓度显示在左侧中。右侧显示了还原型谷胱甘肽(GSH )与GSSG 的比率。GSH / GSSG 的比例较高表明细胞内氧化还原状态降低。所有数据均表示为平均值±SD B )在指定的日期从补料分批和灌注生物反应器中收集细胞沉淀,以确定蛋白质二硫键异构酶(PDI )(〜57 kDa )的变化。对照蛋白质印迹图像显示在左侧中,右侧数据表示为PDI AUC / FKBP12AUC

灌流培养减轻CHO细胞内质网应激

二硫键是在内质网中形成的,其中氧化还原的平衡稳定对于催化二硫键的形成和减少蛋白质的折叠和错误折叠是必不可少的。氧化应激或由于高比生产率而导致的蛋白质折叠率过载会破坏内质网的稳态,称为内质网应激。内质网应激的诱导激活了一个称为未折叠蛋白反应(UPR)的复杂信号网络,它有助于抵抗内质网应激。在内质网应激过程中,结合ATF-6BiP可以从ATF-6中分离出来,结合错折叠蛋白上暴露的疏水区。UPR反应还驱动BiP的上调,以促进再折叠和减轻内质网应激(有利的UPR激活)。如果内质网应激持续,UPR启动由CHOP介导的细胞凋亡。CHOPATF-6的表达上调以响应持续的内质网应激(不利的UPR激活)。因此,为了评估分批投料和灌注过程对内质网应激的影响,我们使用westernblot分析测定了ATF-6CHOPBiP蛋白表达的变化(图6A-D)。我们发现,与灌注过程相比,分批补料过程触发了ATF-6CHOPBiP蛋白表达的上调,这三种蛋白的表达显著增加。具体地说,在稳定生长阶段,与灌注过程相比,分批补料法的ATF-6上调了约3倍(图6B)、CHOP上调约3倍(图6C)和BiP上调约1.5倍(图6D)。我们还注意到,分批补料过程中从第9天开始,ATF-6CHOP在的上调,这表明了UPR介导的细胞凋亡被激活,这也反映在分批补料过程中活性下降(图1B)。综合起来,这些发现表明灌注过程诱导了良好UPR的激活,并缓解了UPR介导的细胞凋亡。灌注诱导的内质网应激缓解改善了内质网的稳定,并减轻了BisAb聚集物的形成。

灌流培养技术可用于减少双特异性抗体的聚集形成

6. 分批补料式和灌流培养过程中的ER 应力分析。在指定的日期从分批补料式和灌流生物反应器中收集细胞沉淀,以使用毛细管蛋白质印迹分析确定ATF-6 CHO BiP 的蛋白表达。FKBP12 作为对照。A )显示了ATF-6 (〜100 kDa ),CHOP (〜27 kDa ),BiP (〜70 kDa )和FKBP12 (〜12 kDa )的代表性蛋白质印迹图像。(B D )蛋白质印迹的光密度分析。数据表示为目标蛋白AUC / 上样对照AUC

讨论

目前我们对影响产物聚集形成的细胞内机制和调节因子缺乏了解。因此,在这项研究中,我们利用灌注和分批补料过程作为工具,证实了细胞比生产率和细胞内氧化还原状态间的协调耦合严格调节聚集物的形成作用。我们发现灌注过程的比生产率较低,产生的BisAb聚集水平较低。相比之下,分批补料法具有更高的比生产率和更高的BisAb聚集水平。如前所述,BisAbs含有工程化的二硫键,这类抗体由于二硫键错配更容易产生聚体。内质网中抗体二硫键的形成受细胞内氧化还原状态的影响。因此,我们在细胞内氧化还原水平比较了分批补料和灌注过程,以确定导致BisAb聚集物形成的机制。众所周知,线粒体是细胞内产生ROS的主要来源,因此是细胞内氧化还原状态的主要调节器。我们发现有效的线粒体功能在调节细胞内氧化还原状态和促进BisAb聚集中起主要作用(图7)。线粒体ROS的产生主要受ETC和耗氧量的调节。消耗的大部分氧气被线粒体用于产生ATP。然而,由于线粒体膜等的损伤,质子通过膜泄漏,进一步增加了氧消耗(非耦合呼吸),并增加了ROS的产生。根据我们对线粒体功能与细胞内氧化还原状态的分析,我们观察到,灌注生物反应器满足细胞ATP需求所需的比耗氧量由于比生产率较低而显著降低(图7)。结果表明,灌注过程降低了线粒体负荷,减轻了ETC功能障碍。因此,灌注诱导的线粒体超氧物生成减少了线粒体对整体的ROS生成。因此,灌注过程保护了CHO细胞免受脂质过氧化和随后的线粒体损伤和去极化的氧化损伤。灌注过程也限制了细胞对重金属离子的吸收,重金属离子可以通过Fenton型反应进一步加剧氧化应激。

谷胱甘肽氧化还原偶联GSHGSSG在维持细胞内质网氧化还原稳态和二硫键形成中起着关键作用。此外,GSH向内质网的转运对于内质网应激所催化形成的非天然二硫键的还原至关重要。我们的数据最终证明,灌注诱导ROS生成和累积的减缓使灌注生物反应器中的CHO细胞能够保持较好的GSH/GSSG比值。灌注过程中良好的细胞内氧化还原环境有助于蛋白质的适当折叠和内质网中聚集蛋白的减少(图7)。相比之下,分批补料生物反应器中较高的谷胱甘肽氧化可能是线粒体和内质网产生较高ROS的综合效应,这两种反应器分别具有较高的比生产力和蛋白质折叠负荷。此外,在内质网应激下,UPR信号级联的激活上调了BiP的催化活性,进一步促进氧化折叠和增加错配二硫键的形成,最终导致BisAb聚集体的形成。虽然我们目前的研究局限于PDI的表达而不是PDI的活性,但是观察到PDI在这两个过程中的表达没有显著差异。总的来说,这些数据表明氧化应激诱导的谷胱甘肽氧化作用可以减轻由细胞内BisAb聚集导致错配二硫键的还原。此外,内质网应激诱导UPR激活上调了蛋白质折叠和错配二硫键的形成,进一步增加了分批补料过程中BisAb聚集体的形成。

总之,我们的研究结果阐明了灌注生物反应器比间歇式补料生物反应器维持更有利的细胞内环境,并为我们提供了有关细胞内BisAb聚集物形成的机制的新见解。在这项研究中,我们最终证明了培养过程和细胞内环境的变化如何显著影响线粒体健康、氧化还原稳定性和内质网功能以及协同调节产物聚集物的形成。据我们所知,这是第一个证明线粒体内质网活性对产品质量的调节作用的研究,特别是在BisAb生产中。我们的研究清楚地证明了远程监测细胞内氧化还原状态和细胞外参数在生产过程中的重要性。由于有效的线粒体功能和谷胱甘肽代谢对于一个巨大的细胞培养过程是关键的,因此应监测细胞内氧化还原状态,以开发下一代平台过程,减少产品聚集的形成。本研究所获得的知识也可用于基于细胞内氧化还原状态的细胞系工程和的克隆选择过程。这可以进一步提高整体细胞生产力和减少产品总量。最后,我们关于细胞内氧化还原状态和产物聚集物形成之间相互作用的观察结果可能适用于所有含有二硫键的治疗性蛋白质的过程开发,包括抗体-药物结合物、单克隆抗体肽结合物和融合蛋白。

灌流培养技术可用于减少双特异性抗体的聚集形成

7. CHO细胞过程中BisAb聚集的细胞内机制示意图。描绘了分批补料式培养(左侧)和灌流培养(右侧)之间的细胞内机制差异。左侧:较高的特定生产力(Qp)和氧化损伤引起的活性氧(ROS)积累,削弱了细胞内谷胱甘肽的调节并破坏了ER稳态,导致BisAb聚集增加。右侧:减轻细胞内ROS的积累可减轻谷胱甘肽的氧化并提高还原型谷胱甘肽的氧化率。在灌流培养过程中有效的调节细胞内氧化型谷胱甘肽和较低的Qp保护CHO细胞免受ER应激并减轻BisAb聚体形成。

参考文献:

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