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10月18日

重磅!我国科学家成功建立基于假病毒的新冠病毒临床血清及相应生物制品中中和活性抗体定量检测方法

作者 : admin | 分类 : 生物医学 | 超过 9 人围观 | 已有 0 人发表了看法
原标题:重磅!我国科学家成功建立基于假病毒的新冠病毒临床血清及相应生物制品中中和活性抗体定量检测方法

假病毒由于其安全性高和用途广泛而成为病毒学研究中的有力工具。近日, 由 中国食品药品检定研究院王佑春教授团队联合北京协和医学院,武汉生物制品所等多家单位合作开发了一种基于VSV(水疱性口炎病毒) SARS-CoV-2假病毒生产系统,可用于SARS-CoV-2病毒中和抗体或侵入抑制剂效果的检测与评价。该系统包括生产,滴定SARS-CoV-2 S假病毒以及基于它的中和抗体测定。 可以评估不同样品对病毒附着和进入细胞的阻断效果,包括来源于动物和人的血清样品,单克隆抗体,病毒融合抑制剂(多肽或小分子)。试验周期约2天,具有检测通量高、快速、简便和经济的特点相关研究成果发表在知名学术期刊 Nature Protocol。

重磅!我国科学家成功建立基于假病毒的新冠病毒临床血清及相应生物制品中中和活性抗体定量检测方法

截至2020年8月6日,全球已确诊由严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)感染引起的冠状病毒病(COVID-19)1800万例。COVID-19的治疗药物和预防疫苗的研发是当务之急。由于SARS-CoV-2的高致病性和传染性,所有使用活病毒评估相关产品效果的试验都必须在生物安全三级(BSL-3)实验室进行,这在相当程度上阻碍了疫苗和相关药物的研发进程。因此,迫切需要安全性好,可操作性强且易于实现标准化的方法来评估临床前和临床阶段的疫苗或药物的抗病毒效果。此外,检测抗SARS-CoV-2的中和抗体还将有助于了解COVID-19患者和无症状携带者中保护性免疫应答的状态。

SARS-CoV–2是单链正义RNA病毒,属于冠状病毒科的β-冠状病毒属。它是已知的最大的RNA病毒之一,其基因组长度约为29.8 kb。基因组的前2/3是非结构基因,主要编码与病毒复制相关的酶,后1/3依次编码四种结构蛋白:刺突蛋白(S),小包膜蛋白(E),基质蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)。其中,S蛋白含有病毒受体的结合区,介导病毒吸附和进入细胞的过程。冠状病毒的S蛋白是在病毒感染人体后刺激免疫系统产生中和抗体的主要蛋白。已分离出多种针对冠状病毒S蛋白的单克隆中和抗体。此外,在其他冠状病毒研究中也发现了靶向S蛋白的抑制病毒与细胞融合的多肽或小分子可有效抑制病毒进入敏感细胞。因此,S蛋白是设计SARS-CoV-2疫苗和治疗药品的主要靶标。

SARS-CoV-2的S蛋白被认为是诱导中和抗体的主要抗原,目前已建立的基本都是基于ELISA等技术的免疫检测方法, 虽在用于评估疫苗免疫后产生的保护性免疫应答或患者体内的保护性免疫应答。但都是针对S蛋白特定区域的结合抗体而非真正的中和抗体,也就难以预测抗体对病毒的中和作用以及对宿主的保护效果。评估SARS-CoV-2疫苗诱导的中和抗体的最直接方法是使用活病毒的感染中和试验或感染抑制试验,但是活病毒的操作必须在BSL-3实验室中进行,受实验条件和病毒来源等因素的限制。另外, 由于病毒株,培养条件和结果解释标准的不同,不同实验室的活病毒检测结果常常存一定的差异。

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基于SARS-CoV-2活病毒应用于相关检分析试验中存在的种种局限,本研究建立了一种基于水疱性口炎病毒(VSV)的假病毒检测系统用于SARS-CoV-2中和抗体的检测和定量分析。将全长S蛋白插入假病毒颗粒中,假病毒将以与活病毒相同的方式进入细胞。本研究中构建的假病毒可用于评价所有类型的中和抗体以及针对S蛋白设计的小分子在阻止病毒进入细胞方面的效果。本研究中的假病毒是通过在293T细胞内转染S蛋白表达质粒的同时感染G *ΔG-VSV制备的。活病毒在扩增和传代过程中常发生基因突变, 对检测结果的影响较大, 而假病毒在感染细胞后不再复制,因此检测结果更加稳定,并且假病毒可以在BSL-2条件下进行所有相关的操作。本研究中构建的假病毒带有荧光素酶报告基因,可以通过荧光测定仪(也称化学发光仪或液闪测定仪)准确地检测报告基因的表达, 实现病毒的定量检测。该测定法可通过进一步优化实现高通量检测和标准化检测。通过替换S蛋白表达质粒(蛋白质编码基因),可以研究抗S蛋白抗体针对不同突变株的交叉中和作用。该假病毒检测系统除了用于评估中和抗体效价和病毒进入抑制剂在阻断病毒入侵细胞过程中的效果外,它还可以用于研究病毒的细胞嗜性和受体识别方式。

重磅!我国科学家成功建立基于假病毒的新冠病毒临床血清及相应生物制品中中和活性抗体定量检测方法

图1:制备SARS-CoV-2假型病毒和中和检测的步骤

小贴士:假病毒和活病毒之间的主要区别点及方法学相关:

  • 假病毒进入细胞后只能完成单个复制周期,这比活病毒更安全。
  • 假病毒仅包含SARS-CoV-2的 S 蛋白。因此,假病毒系统只能评估针对 S 蛋白的中和抗体效价,而不能评估其它结构或非结构蛋白诱导产生的中和抗体 , 当然除S蛋白之外的其它病毒蛋白是否可以诱导中和抗体尚存在争议。
  • 假病毒感染细胞后,它无法完成与活病毒相同的生命周期,因此无法评估疫苗或药物在病毒进入细胞后, 对其复制的抑制作用。
  • 假病毒颗粒表面上S蛋白的数量可能会影响中和抗体检测试验的灵敏度 , S蛋白的数量是否与活病毒相当还需要进一步研究。
  • 与其他慢病毒系统相比,该假病毒系统具有病毒滴度高,检测精度和重复性更好。另外,由于VSV的复制时间更短 , 因此孵育时间也就越短 , 由此检测效率更高。
  • 假病毒检测系统在建立和应用时,有必要与活病毒进行比较和验证,以确保其对活病毒检测方法的可替代性与可比较性。

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