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10月09日

亲和蛋白A淋洗策略

作者 : admin | 分类 : 生物医学 | 超过 8 人围观 | 已有 0 人发表了看法
原标题:亲和蛋白A淋洗策略

蛋白A亲和层析可提供有效的单克隆抗体(MAb)纯化,并广泛用于大规模MAb生产。与大多数层析介质一样,蛋白A树脂通常具有一定程度的非特异性结合,这会导致宿主细胞蛋白(HCP)与MAb一起被洗脱下来。为了减少非特异性结合相互作用,可以在目标产物洗脱之前进行中间淋洗步骤。这样做可以提高产品纯度,延长层析柱寿命,并有可能减少后续的进一步精纯步骤。对于大规模的纯化过程,优化淋洗和洗脱条件以最大程度地提高产率是非常值得的。中间淋洗条件通常取决于特定层析树脂的特定层析条件。下面我们选择了两种蛋白A层析填料来举例说明,具体填料名称和厂家名称就不提及了。

除了pH和盐条件之外,我们还研究了精氨酸和盐酸胍(GuHCl)等添加剂对淋洗的效果。我们选择了一些条件来中断HCP与蛋白A层析介质,或HCP与蛋白A结合抗体的相互作用。实验使用96孔板筛选了20多种不同的组合,以确定最佳条件。实验的关键参数是HCP和洗脱样品的产率。

1 材料、方法和设备

抗体的产生,表达量>0.5mg/mL。用于实验的层析介质,并将其分配到96孔板(Whatman透明聚苯乙烯0.45μm亲水PVDF)中。对于层析柱实验,我们使用的层析色谱柱为:内径1厘米×床高5厘米。ÄKTA Avant 25系统(GE Healthcare,Uppsala,瑞典)。

2 方法

平板筛选研究是基于建立在参考文献的实验方法。下 表1列出了方法的详细信息。使用层析介质平衡,然后在室温下与MAb料液一起孵育60分钟。我们将料液与层析介质体积以1:1的比例加入并沉积到96孔板中,并使用这种筛选方法并行测试了不同的中间淋洗条件。在每个步骤中,我们使用真空过滤(真空泵)从层析介质上洗脱出单克隆抗体,并从板上抽出液体收集。

表1 方法详细信息

步骤 使用缓冲液 淋洗体积(CV) 淋洗时间(min)
平衡 50mM Tris, 25mM NaCl,5 mM EDTA, pH7.2 6 10
上样 料液 30ml 60
平衡 50mM Tris, 25mM NaCl,5 mM EDTA, pH7.2 4 震荡10min
淋洗 几种条件 4 震荡10min
平衡 50mM Tris, 25mM NaCl,5 mM EDTA, pH7.2 5 震荡10min
洗脱 0.1 M乙酸,pH 3 6 震荡10min

在紫外线透明收集板(Corning Costar 3635)中回收了上清液,用于紫外线分析。我们一式三份地筛选每种条件以进行分析。在板筛选研究中使用的层析方法、步骤、缓冲液和柱体积也用于后续的层析柱研究。我们使用CHO HCP酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒免疫测定法测定了HCP含量。抗体产率基于280nm处的UV吸收。

3 高通量筛选结果与讨论

我们研究选择了中间淋洗条件,以筛选一系列盐类型、盐浓度、pH值和添加剂(精氨酸,盐酸胍,乙二醇分子)。目的是中断HCP与蛋白A或HCP与蛋白A结合抗体的相互作用。我们基于平衡缓冲液的中间淋洗液作为本研究的基准,根据其对产品收率和HCP去除的影响评估了筛选条件。由平衡缓冲液组成的中间淋洗液并不总是最合适的淋洗条件,并且不能选择性地破坏HCP与蛋白A层析介质或HCP与蛋白A介质结合抗体的相互作用。平衡缓冲液也不太可能破坏抗体与蛋白A的相互作用,从而提供高产量。

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图1显示了使用平衡缓冲液作为中间淋洗缓冲液获得的基础数据。该图还显示了与由0.1 M柠檬酸,pH5.5组成的中间淋洗液的比较。这种中间淋洗条件显著降低了最终洗脱池中的HCP水平,低于使用平衡缓冲液洗涤所获得的水平。

亲和蛋白A淋洗策略

图1 实验对潜在时间节省和成本的影响

图2显示了中间淋洗缓冲液中不同 精氨酸浓度的结果。精氨酸大大降低了洗脱池中HCP的水平,同时也有助于提高产品产量。这个结果与文献发现是一致的。指出了由平衡缓冲液作为淋洗液(50 mM Tris,25mM NaCl,5mM EDTA,pH7.2)产生的HCP水平。结果表明,中间淋洗液中0.1–1M的精氨酸比平衡缓冲液洗涤液对HCP的去除效果更好。

亲和蛋白A淋洗策略

图2 精氨酸对单抗产量和HCP去除的影响

图3显示了不同浓度 盐酸胍(GuHCl)的影响。我们观察到增加的GuHCl浓度导致洗脱池中的HCP减少。但是,将GuHCl浓度增加到1M以上不会带来进一步的好处,并且在6M GuHCl下MAb的产量开始下降。

亲和蛋白A淋洗策略

图3 盐酸胍对单抗产量和HCP去除的影响

图4显示了各种NaCl浓度和缓冲液pH值的影响。结果表明,两种MAb进料中NaCl浓度的增加不会引起HCP的显着变化。我们观察到这两种条件的变化对单克隆抗体的低pH洗涤效果有限,pH达到4时产率降低。

亲和蛋白A淋洗策略

图4 NaCl浓度和缓冲液pH对MAb产量和HCP去除的影响;(蓝色)pH4,(红色)pH4.5,(绿色)pH5,(紫色)pH5.5

基于96孔板筛选的结果,我们选择了四个最有希望的条件用于层析柱研究中的进一步测试。这些条件是根据产量和HCP结果选择的。下 图5显示了这四个条件。根据板筛选分数据,中间淋洗由50mM Tris,0.5M精氨酸,pH8.5和0.05MTris,2M GuHCl,pH8.5组成,导致两种条件进料的洗脱液中HCP最低。

亲和蛋白A淋洗策略

图5 96孔板筛选中确定的四种最有希望的中间淋洗条件

图6显示了在实验室规模的层析色谱柱测试中使用四种选定的中间淋洗条件的结果。我们观察到了与板筛选研究有相同的趋势,其中0.05M Tris,0.5M精氨酸,pH8.5和0.05M Tris,2M GuHCl,pH8.5导致洗脱池中的最低HCP水平。

亲和蛋白A淋洗策略

图6 96孔板筛选中鉴定出的四种淋洗条件层析柱结果。

考虑到层析柱研究中HCP水平的绝对数与板筛选研究中的绝对数不同,我们将这些值计算为对数减少值(LRV)(如下 图7)。尽管最初的HCP水平并不相同,但这些结果仍使比较HCP的可能性成为可能。

亲和蛋白A淋洗策略

图7 使用层析柱去除宿主细胞蛋白的对数减少值(LRV)

亲和蛋白A淋洗策略

图8 通过层析柱实验和板筛选实验获得的宿主细胞蛋白质去除值的比较

将高通量板筛选与层析柱实验进行比较,当我们比较四种选定的中间淋洗条件下,LRV在层析柱和板筛选实验中的结果是一致的。这进一步验证了96孔板方法适用于这些类型的筛选实验。

通过分析一系列中间淋洗条件产生的HCP水平和产品收率,我们确定了提高产品纯度的几种条件。使用pH5.5的柠檬酸可观察到HCP的大量去除。通常,当使用pH和盐中间淋洗条件时,我们观察到纯度和产率之间的平衡。尽管低pH值的中间淋洗条件在一定程度上降低了HCP含量,但却牺牲了产品收率。我们使用含有0.5M精氨酸(pH≥8)或2MGuHCl(pH8.5)的中间淋洗液,获得了高产量和低HCP含量的最佳组合。这很可能是由于这些试剂的离子性能所致。

4 展望

我们的结果强调了通过适当选择中间淋洗缓冲液来改善蛋白A纯化的潜力。我们证明了中间淋洗条件会显着影响最终洗脱池中的抗体纯度。中间淋洗会破坏HCP与层析介质,以及HCP与目标产品之间的相互作用。有效应用中间淋洗可以提高蛋白质A步骤操作的效率,这最终会影响产品质量和生产率。

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