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10月02日

国庆干货

作者 : admin | 分类 : 生物医学 | 超过 16 人围观 | 已有 0 人发表了看法
原标题:国庆干货|下游工艺不同阶段HCP去除策略

简介

重组治疗蛋白通常是由细胞培养产生的。HCPs(宿主细胞蛋白)是从用于生物生产的宿主细胞中提取的内源性蛋白。HCPs是一种主要的工艺相关杂质,即使处在较低的水平上,它们也可能损害生物制品的安全性和有效性。因此需要通过下游工艺充分去除。HCPs是一种具有多种理化性质的复杂混合物,某些亚种群可以与目标产品结合,将它们降到普遍接受的水平很具有挑战性。本文介绍了单抗和Fc融合蛋白在下游工艺不同阶段的HCPs清除策略。当结合使用这些策略时,可大大提高药物符合残留HCPs规格的机会。

一、澄清

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染色质提取

细胞培养液中的HCP水平取决于细胞培养工艺和收获条件。研究表明,从死亡宿主细胞中释放的chromatin是聚体形成和宿主细胞污染来源的主要原因。chromatin主要由DNA和组蛋白构成,两者都具有易于和非组蛋白HCP,单抗结合的高活性表面。chromatin主要以复杂的多聚体形式存在,该多聚体由DNA,组蛋白核心以及非组蛋白HCP,单抗组成,与单抗相比,该多聚体结合protein A树脂更坚固。洗脱过程中,结合在protein A上的chromatin聚体leachates也是洗脱液中HCP污染主要来源。

某种意义上,chromatin作为其他污染物聚集的成核中心,同时也是通过纯化步骤“偷渡”HCP的工具,因此最好在澄清阶段去除chromatin聚体。实际上,与正常的protein A上样相比,去除chromatin的上样会产生更低水平的HCP洗脱液。Gagon团队已经尝试了一些去除收获液中chromatin残留物方法。一种方法是通过添加allantoin和ethacridine,聚集chromatin异质聚体,产生的沉淀通过膜过滤去除,获得的澄清液然后经过一个多孔颗粒混合柱,包括阴阳离子交换剂和金属螯合剂,这种方法可以有效去除>98%的DNA和组蛋白,30%-70%的HCP。

尽管一些作者并未提及chromatin,但是在捕获之前通过沉淀聚集方法去除细胞培养杂质的想法早已被其他团队提及过,研究提到,短链脂肪酸辛酸被证明可以有效聚集HCP和DNA。

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絮凝

近年来,优化后的培养基使高密度发酵液变得较为普遍,为了解决更高的固含量问题,生产规模澄清所需的深层滤器面积也大大增加。为克服这一挑战,添加絮凝剂絮凝细胞收获液中杂质的方法已被广泛应用。经常被使用的一类絮凝剂(如chitosan, DEAE, pDADMAC等)是阳离子聚合物,可促进带负电的细胞和细胞碎片形成更大的颗粒,此外,这些絮凝剂与DNA和带负电的的HCP反应,促进它们聚集和之后的去除。絮凝的有效性取决于不同因素,包括絮凝剂的添加量,盐浓度,pH范围等。

絮凝处理后的收获液通常经过连续流离心加深层过滤方法进行澄清。因为絮凝剂促成的更大颗粒易于通过离心去除(没有絮凝剂的情况下,亚微颗粒在离心机中可以逃离沉淀),之后的深层过滤可获得较高的体积载量。絮凝剂处理后的澄清也可通过专门为含有大颗粒的预处理后的料液设计的滤器实现(如来自Millipore的clarisolve深层滤器)。在特定条件下,HCP含量会受到轻微影响,但DNA水平会减少90%。此外如上一章节显示,减少protein A上样中DNA水平有很大益处,它可以极大加强protein A HCP载量去除。

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深层过滤

深层过滤,无论是单独的还是和离心结合使用,已经被广泛的应用于收获澄清。许多互相补充的分离机制涉及其中。除了通过机筛截留细胞碎片/大颗粒,带负电的深层滤器可以通过吸附作用来捕获可溶解的亚微颗粒。因此,深层滤器致力于整体的HCP去除。HCP通过静电和疏水作用机制去除。值得注意的是,上样发酵液或离心后的收获液对HCP的有效去除有很大的影响。一旦达到饱和状态,随着载量增加HCP将会流穿。多阶段深层过滤(通过一连串的深层滤器过滤)能更好的去除HCP。在滤器选择和放大评估时,深层滤器去除HCP的能力经常被忽略。强烈推荐,在选择一个滤器和确定其操作参数时,除了上样载量,也要评估和考虑HCP去除载量。

一篇报告显示,一种应用于离心和深层过滤后的AEX层析澄清capsule可作为一种精细深层过滤(如3M’s Emphaze AEX Hybrid Purified capsule),比传统的深层滤器去除HCP更有效。这种一次性的capsule含有一种新型的AEX水凝胶基质和一种细粒度截流膜。AEX配基优先去除酸性HCP和DNA。除了澄清阶段的HCP降低,这种产品对protein A阶段HCP的去除具有一定的积极作用。与深层过滤后的上样相比,3M’s Emphaze AEX Hybrid Purified capsule处理后的上样会导致洗脱液中的HCP减少19倍。考虑到capsule强大的DNA去除能力,protein A表现增强极有可能是由于提前去除了chromatin异质聚体。

二、亲和阶段强化wash

亲和层析由于其对IgG Fc片段高度特异性,通常用于澄清后发酵液抗体直接捕获。亲和树脂的高度选择性让大多数非目标蛋白流穿。此外,由于其对抗体的高度亲和,相对恶劣的条件才能将其洗脱。因此,亲和层析是下游工艺中最有效的去除HCP的单元操作。这一单独步骤可以去除澄清收获液中>90%的HCP。但是,尽管亲和层析能高效去除HCP,根据原料不同,亲和洗脱液中HCP的水平也有很大差异。

一些团队已经证明,HCP和亲和树脂间的非特异性作用对HCP残留起到很小的作用,然而抗体-HCP间的作用却是亲和洗脱液中HCP水平不同的主要原因。在一项研究中,在空白组HCCF(harvested cell culture fluid)中spike与抗体浓度相同的21种不同单抗。经过亲和纯化后,spike抗体的洗脱液中HCP更高,洗脱HCP水平有大于2个数量级的差别。这项研究有力的证明,HCP-单抗作用是亲和阶段HCP去除的差异的主要原因。如上一章节所介绍,Gagon团队暗示chromatin在协调抗体-HCP作用中承担重要角色。无论作用机制是什么,直接还是chromatin调节,结合抗体的HCP是最难去除的HCP类别,打破抗体-HCP作用是去除这类产品关联污染物的关键。

上样后wash是减少HCP的主要方法。总的来说,它显著地提高了HCP的去除,减缓了后续纯化工艺的压力。通常,不是那么严格的pH条件被用来wash(pH5-5.5)。但是这种中间pH wash只能去除与亲和树脂结合较弱的HCP,不足以打破抗体-HCP作用。而且,在这样的条件下尤其是高载时,单抗会被部分洗脱,低pH中间wash可能会损失收率。最近一项研究表明,碱性缓冲液在用作中间wash时比酸性缓冲液在减少HCP方面更有效。大多数CHO HCPs等电点在4.5-7.0,在酸性pH条件下,单抗通常是电中性或带正电而绝大多数HCP是电中性或带负电,因此单抗和HCPs间形成很强的疏水作用和静电作用。在碱性pH条件下(>8),单抗和大多数的HCP是带负电的,静电作用被转换成排斥力。抗体在相对较高的pH条件下通常可维持稳定,但是pH高于10,会产生天冬酰胺残基脱氨作用。因此推荐使用pH8-10之间的缓冲液。

因为产品关联HCPs可能通过多种机制与单抗结合,包括静电作用,疏水作用和氢键,所以打破这些作用的试剂可以用来有效地去除HCP。一些团队尝试了用不同含有添加剂的溶剂进行wash并且评估它们去除HCP的有效性。可有效减少产品关联HCP的wash添加剂的选择如表格1所示,包括离液序列高的盐,有机溶剂和去垢剂。总的来说,高浓度添加剂和高pH的wash缓冲液可以有效打破抗体-HCP之间的非特异性作用,而且能获得很好的产品回收率。添加剂结合使用可以带来更好的结果。

在所有被测试的添加剂中,NaCl是最常用的,精氨酸是最有效的,因为它在不影响收率的情况下大幅度降低洗脱液中HCP水平。这个结果不惊奇,因为精氨酸被熟知用来缓解静电作用,疏水作用和氢键。而且,不像其他蛋白作用破坏剂例如尿素和GdnHCl,它们可以折叠蛋白,精氨酸不能折叠或使蛋白灭活。事实上,精氨酸可以稳定蛋白,抑制蛋白聚集,精氨酸wash可以导致低浊度的酸性和中性亲和洗脱液。值得注意的是,高浓度的精氨酸(2M)可以在pH5.3洗脱单抗,因此中等浓度精氨酸碱性pH的缓冲液可以被用来避免提前洗脱。

亲和层析精氨酸wash作为一种HCP去除策略,也是专利的主要内容。与研究文章一致,这些专利呈现的数据进一步证明与其他可替代的添加剂(NaCl, isopropanol, GdnHCl) 相比,精氨酸在减少HCP方面更有效。根据Frauenschuh和Bill所述,当wash缓冲液除了精氨酸还有非缓冲能力的NaCl且pH大于8时,可更好的去除HCP。碱性pH可部分变性HCP,变性带来的构像改变足够弱化杂质和目标蛋白或亲和基质之间的非特异性作用。

三、病毒灭活后中和

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中和pH优化

典型的纯化平台中,亲和层析的下一步是低pH病毒灭活,低pH病毒灭活完成后,产品pool需要中和到一个合适的pH以利于下一步上样。在病毒灭活和接下来的pH调节中可以看到大量的沉淀和浊度增加。Chollangi团队仔细的研究了这一现象。他们把病毒灭活后的pool调节到不同pH值,4.0-8.5之间,每次pH增加0.5,结果发现pool最大浊度出现在5.0-7.5之间,还发现沉淀与选择性HCP去除间有很大联系。正如之前的章节提到,大多数HCP的等电点在4.5-7.0之间,当被滴定到这一pH范围就会变得难溶。因此,根据目标单抗的性质,可选择一个最佳的中和pH来沉淀HCP,同时使产品损失最小化。

Brodsky团队证明,辛酸可以用在这一阶段有效地沉淀HCP。结果显示,1%的辛酸已足够用来低pH灭活而且最佳的沉淀pH范围在5.0-5.4之间。除此之外,另一项研究表明,在特定的pH条件下,通添加PEG可导致更多的杂质沉淀,但是要牺牲一部分收率。也可以在细胞发酵液收获阶段进行低pH沉淀HCP,但是结果发现,单独的低pH只能减少20%左右的HCP,为了HCP沉淀最大化也需要其他添加剂。

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中间品深层

因为深层滤器可以同时去除颗粒和可溶性污染物,所以它们是清除pH导致的中和后沉淀的最佳选择。结果显示,pH调节后的亲和洗脱液经深层滤器(如X0HC)处理后与只经过0.2微米滤器过滤相比,会产生更低水平的的HCP,这进一步证明,深层滤器不仅去除沉淀的HCP还去除残留在溶液中的HCP。此外,结果发现之后的AEX流穿步骤并不能提供额外的HCP清除能力。深层滤器HCP去除载量归功于其静电疏水作用调节的吸附特性。一般的深层滤器携带正电荷,增加进料端pH通常会导致更多的HCP去除但会降低单抗收率。因此,需要选择一个pH来平衡HCP沉淀,吸附和产品收率。

根据CR40的应用介绍,在亲和层析洗脱液的对比测试中,活性炭的表现优于X0HC滤器。但是在pH7.5和5.0时,当上样载量达到40L/m2时,X0HC滤器上HCP流穿达到25%和75%。即使载量达到150L/m2,CR40上的HCP流穿依然低于10%。因此用CR40取代A1HC/X0HC不仅可提高上样载量,还可同时达到HCP去除和提高收率的目的。在最优的条件下(最优的pH加上高载量滤器),低pH灭活后的中和深层过滤对HCP的去除总量将会有显著影响。

三、精纯步骤

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AEX弱分离层析

在抗体工艺中,精纯步骤之一几乎必定是AEX。大多数抗体有一个相对较高的pI(6.5-9.0),像HCPs、DNA和病毒这样的杂质通常是酸性的,比产品结合resin更牢固。因此,AEX通常以流穿的模式运行。在低于目标蛋白等电点的pH和较低电导的条件下,样品从柱子上流穿然而带负电的杂质却结合在resin上。然而弱结合流穿模式的AEX去除HCPs和其他杂质,具有更优越的除杂性能。在弱结合模式下,选择适当的pH和电导促进目标蛋白与resin弱结合(产品分离系数范围是0.1-20,最好选在1-3之间),在这样条件下,杂质结合得更牢固。因此,流穿模式不能去除的弱结合杂质被保留在柱子上,导致更高纯度的流穿pool。由于弱结合导致的产品损失可通过增加载量、上样后再结合一段wash的方式缩减至最小。在优化的条件下,可去除4LRV的HCP。相比于只能去除<1LRV的流穿模式,只是一个很大的改善。事实上,弱分离AEX杂质去除的载量很高,甚至使两个柱子的工艺变为可能。除了AEX,其他杂质比产品结合resin更牢固的层析工艺也可以运用弱分离模式。

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混合模式层析

其他应用在精纯阶段的层析步骤包括CEX、疏水层析和混合模式层析。在它们之中,混合模式resin很特别,因为它们的配基可以协调不只一种类型的交互作用。除此之外,不是简单的加法组合,不同的交互作用显示了协同效应。抗体表面疏水和和带电补丁的分布与大多数HCPs表面分布不同。因此,混合模式的resin经常显现不同于传统模式配基的选择性和特异性。它们特殊的性质给与杂质去除极大潜力。事实上,混合模式resin凭借其HCP精纯步骤和杂质去除能力正在寻找更多的应用。值得注意的是,由于与混合模式reisn相关的固有复杂性(各种因素制约的多样相互作用),为了充分利用,需要进行广泛的优化。

Capto Adhere和Capto MMC是来自GE的两款比较新且广泛应用的混合模式层析resin。Capto Adhere是一款专门为中间品纯化和精纯设计的多模式阴离子交换剂。除了离子交互作用,最重要的是,它的配基显示了氢键结合和疏水相互作用的功能。与AEX相似,Capto Adhere主要运用流穿模式,抗体流穿过柱子杂质被吸附。Capto Adhere的多模式配基与传统模式的AEX基质相比展示了提高的选择性。总的来说,可以去除2-3LRV的HCPs。一篇报告中,Capto Adhere运用结合洗脱模式显示了更好的HCP去除能力。事实上,在这个特殊案例中,Capto Adhere是5种被测resin中唯一一个能连续达到2 log HCP去除能力的resin且HCP水平能达到低于10ppm。来自于同一家族的Capto MMC是另外一款混合模式resin,它的配基拥有阳离子和疏水部分。通常运用结合洗脱模式,显示了较好的HCPs和杂质去除能力。此外,已被证实,中间品wash应用了不同的调节剂,与亲和步骤描述的相似,可以提高HCP去除能力。

HA(羟基磷灰石)结合了阳离子交换和金属亲和相互作用,是最典型的混合模式resin,可以追溯到上个世纪50年代。但是HA最广为人知的作用是其去除抗体多聚体的卓越能力,HCP也支持其他污染物如HCPs的去除。根据Snyder的研究结果,HA去除HCP可高达2LRV。在VB4-845(E.coli表达的一种免疫毒素)临床三期纯化工艺开发中,HA显示出比CEX或疏水resin更好的HCP去除能力。在某些确定的条件下,目标蛋白在流穿液中然而绝大部分的HCPs结合在resin上。

四、高性能切向流过滤UF/DF

HPTFF(high-performance tangential-flow filtration)是一个独特的膜分离操作,允许纯化、浓缩和换液在一步完成。它结合了层析和UF/DF。在常规的TFF中,产品截留只是单独的通过尺寸效应来实现。HPTFF不同的是,它探索了生物分子尺寸和带电性质的差异,因此可以分离尺寸相似的蛋白。事实上,在适当的条件下可以让更小的分子截留,较大的分子穿过膜。

HPTFF一个重要特性是使用带电荷膜来加强带有同种电荷蛋白的截留(传统的TFF运用中性膜),尽管它们小的可以穿过膜孔。缓冲液pH和离子强度的选择至关重要,因为它们都对蛋白的截留行为有影响。HPTFF区别于常规TFF的另一个特征是在压力相关而非压力无关的流量范围内,可获得最佳的选择性和载量。在特定的pH条件下,带正电荷的膜上,目标产品拥有正电荷,杂质是电中性的,会导致产品的低通过和杂质的高通过。有案例显示,纯化E.coli表达的抗体片段,HPTFF可以减少10倍HCPs。HPTFF可以去除HCPs到很低水平(<10ppm)的能力已经被证实了。在整个UFDF阶段,抗体的筛分系数比CHO HCPs低两个数量级,实现高收率和良好的HCP去除。尽管HPTFF可以运用在整个纯化工艺阶段以此来去除杂质,但是通常在UFDF实施这一操作。

总结

对于非产品相关的HCPs,可根据污染物的物理化学性质(如pI、分子大小、疏水性等)设计去除策略。例如,病毒灭活pH优化和使用含活性炭的过滤器进行中间品深层过滤进行选择性沉淀去除HCPs。这是基于大多数HCPs的pI小于7分子量小于75kDa的原理。实际数据显示,持久且难以去除的HCPs是那些与产品相关的HCPs,打破HCPs与目标蛋白的相互作用是有效分离的关键。例如,增加染色质提取和强化亲和wash的操作,减小和破坏HCPs和目标蛋白间的直接和间接非共价相互作用。

在一定的pH条件下,当mAb结合层析柱时,HCPs可能会流穿层析柱。为了更有效的清楚HCPs,建议在洗脱前使用高pH和高电导的缓冲液进行wash。为了提高分辨率,有时也可使用线性pH和电导双梯度(增加pH和降低盐浓度,降低pH和增加盐浓度)洗脱。虽然没有一种策略可单独有效的解决HCPs问题,但是每一种策略都极大提高了相关单元操作的HCPs去除能力。每种策略的相对有效性在不同情况下是不同的,最大的区别通常在于抗体和Fc融合蛋白。例如,病毒灭活后中和以及中间品深层过滤通常是抗体去除HCPs的一个稳健操作,但在Fc融合蛋白的情况下可能不是那么有效,因为Fc融合蛋白的平均pI低于抗体。对于Fc融合蛋白,混合模式的层析方法是一种有效的HCPs去除策略。尽管条件不同,但是本文介绍的一些策略增加了整个过程的稳健性,提高了在最差的条件下HCPs去除的药物规范的机会。因此,当与上游工艺优化结合时,实施一个或多个策略可以显著减少特定项目的开发工作并为下游工艺节省成本(例如两步工艺流程)。

国庆干货

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