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09月09日

靶向降解BRAF突变体V600E的PROTAC分子设计

作者 : admin | 分类 : 生物医学 | 超过 10 人围观 | 已有 0 人发表了看法
原标题:靶向降解BRAF突变体V600E的PROTAC分子设计

RAF家族激酶是细胞增殖的关键调节剂,为EGFR或小GTP激酶 RAS的下游蛋白,常见的信号通路为RAS–RAF–MEK–ERK途径。通常通过突变RAS或RAF使其功能激活,使得下游靶蛋白过度磷酸化,导致通路信号失调,最终引起癌症的发生和发展。其中BRAF(V600E)是目前研究的重要靶点,临床上使用dabrafenib,vemurafenib和encorafenib等靶向抑制剂治疗相关疾病。虽然这些抑制剂显示出了抗BRAF(V600E)驱动肿瘤的活性,但由于RAS和EGFR等成分仍然存在,后期依然会通过RAS-ERK途径的信号促进肿瘤生长。此外,由于RAF蛋白容易二聚化,会导致这些药物治疗效果降低。因此,急需一类能克服这些问题的新药。近期,加拿大多伦多大学的研究团队通过开发靶向BRAF(V600E)的PROTAC分子,提出了一种新型抑制BRAF(V600E)驱动的癌症治疗的概念。

靶向降解BRAF突变体V600E的PROTAC分子设计

靶向降解BRAF突变体V600E的PROTAC分子设计

研究人员随后利用黑色素瘤细胞A375(纯和BARF V600E突变)确认了P4B确实可以靶向降解 BRAF V600E蛋白,以及对下游ERK和MEK的磷酸化有显著的抑制作用。并且通过利用MLN4924:类泛素化抑制剂;MG-132:蛋白酶体抑制剂;Pomalidomide:E3泛素连接酶粘合剂和蛋白泛素化检测,证明了P4B通过给BRAF V600E蛋白标记泛素化并通过蛋白酶体途径进行降解。

靶向降解BRAF突变体V600E的PROTAC分子设计

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靶向降解BRAF突变体V600E的PROTAC分子设计

研究人员在其他BRAF不同类型的细胞检测了P4B的作用效果,发现在BRAF V600D和G466V突变体细胞中是有效的,尤其是在vemurafenib抗性细胞株A375-VR(其中一条染色体串联突变)是有效的,说明P4B有望克服之前抑制剂耐药问题。之前实验的所有细胞系都是RAS WT型的细胞。临床上的抑制剂都是可以激活RAS,并且将BRAF V600E由单体状态转化二聚体状态,最终对这些抑制剂产生抗性。研究人员在将BRAF V600E细胞中的RAS敲出之后,P4B的功能不受影响.但RAS突变激活之后,P4B抑制细胞的增殖效果和降低下游蛋白的磷酸化效果都大大降低。因此,RAS的突变激活能够使得细胞激活对P4B抵抗作用。

靶向降解BRAF突变体V600E的PROTAC分子设计

但P4B 在BRAF其他突变体以及野生型(WT)中是几乎无效的。P4B抑制细胞的增殖效果和降低下游蛋白的磷酸化效果都大大降低。为了探究P4B在BRAF V600E和WT之间的区别,利用IP实验发现P4B拉下蛋白中BRAF V600E多于BRAF WT。但在FP实验中,却发现P4B和E3泛素连接酶(CRBN)以及BRAF V600E/BRAFWT三元复合物的结合并没有明显差异。MEK可以结合BRAF以影响P4B的结合,当体系中加入MEK以及突变体MEK(F311S),FP实验证明P4B降解BRAF V600E和BRAFWT之间的差异是由于MEK的结合。

这项工作证明了PROTAC分子P4B能够治疗某些抗传统抑制剂治疗的BRAF突变驱动的细胞系的应用前景,并且对于目前临床上尚无药物的BRAF串联突变细胞系也是有一定效果,将来可以补充这方面的空白。另外,这项工作系统的阐明了P4B受MEK和BRAF WT相互作用倾向于降解BRAF V600E的作用机制,以及RAS的激活将BRAF V600E由单体状态转向二聚体状态从而阻断P4B的作用效果。未来如果利用中间连接片段或者新型E3泛素连接酶的粘合剂能够将BRAF V600E固定在单体状态,将大大拓展PROTAC分子P4B的作用范围以及未来临床应用前景。

参考文献

Posternak, G., Tang, X., Maisonneuve, P. etal. Functional characterization of a PROTAC directed against BRAFmutant V600E. Nat Chem Biol (2020).

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